تور مسافرتی تور هند تور ترکیه تور تایلند تور دبی طراحی سایت تور ترکیه ساندویچ پانل تور چین رپرتاژ آگهیاقامت گرجستان بازاریابی ویروسی
جستجو برای:
جستجو …
کلمات کلیدی بیشتر جستجو شده :
فیزیولوژیکیکاهش ارزشمشاور خارجیولی خاصمولفه های سازمانیشکاف نیازها و خواسته های مشتریان

 

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب:

فصل اول: مقدمه و مروری بر منابع

1-مقدمه………………………………………………………………………………………………………………. 2

1-1- مقدمه‏ای بر مرکبات………………………………………………………………………2

1-2- تاریخچه‌ی کشت درختان مرکبات در ایران و جهان…………………………………………4

1-3- سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهان…………………….4

1-4- اهمیت و انواع بیماری‌های مرکبات…………………………………………………………6

1-4-1- تاریخچه و اهمیت بیماری شانکر مرکبات……………………………………………….7

1-4-2- عامل بیماری…………………………………………………………………………10

1-4-3- علایم و چرخه‌ی بیماری………………………………………………………………13

1-4-4- ابزارهای ایجاد بیماری تحت اختیار باکتری……………………………………………..14

1-4-5- جذب، اتصال و ورود باکتری به گیاه……………………………………………………14

1-4-6- سیستم‌های ترشحی باکتری……………………………………………………………15

1-4-7- سیستم ترشحی نوع III (TTSS)………………………………………………………16

1-4-8- ژن‌های hrp و نقش دوگانه‌ی آنها……………………………………………………….17

1-4-9- هارپین‌ها و نقش آنها در القای پاسخ ………………………………………………HR20

1-5- بهره‌گیری از مهندسی ژنتیک در مقاومت به بیماری‌ها………………………………………21

فصل دوم: مواد و روش‏ها

2- محل انجام پژوهش……………………………………………………………………………………………..25                                                                                                                                                                           25

2-1- مواد شیمیایی، آنزیم‏ها و کیت‏ها………………………………………………………….25

2-2- سویه‏های باکتری………………………………………………………………………..25

2-3- پلاسمیدهای مورد استفاده……………………………………………………………….26

2-4- محیط کشت باکتری‏ها…………………………………………………………………….26

2-5- آنتی‏بیوتیک‏ها……………………………………………………………………………27

2-6- طراحی آغازگر………………………………………………………………………….27

2-7- شناسایی و جداسازی باکتری Xcc…………………………………………………………………………………….29

2-8- خالص سازی DNA ژنومی باکتری Xcc سویه‏ی ………………………..NIGEB.088(A*)31

2-9- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……………………………………………….31

2-10- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم‏هایTaq  و Pfu دی.ان.آ پلیمراز جهت جداسازی ژن‏های هدف……………………………………………………………………………………………………………………………………..31

2-11- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………33

2-12- خالص‏سازی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….33

2-13- جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز……………34

2-14- هضم آنزیمی با آنزیم‏های محدود کننده تیپ …………………………………………..II35

2-15- الکتروفورز محصولات واکنش‏های هضم آنزیمی…………………………………………39

2-16- واکنش اتصال………………………………………………………………………….39

2-17- تکثیر پلاسمید………………………………………………………………………….42

2-18- اندازه‏گیری دانسیته نوری(OD) باکتری…………………………………………………..42

2-19- تکنیک Colony-PCR: غربالگری کلونی‏های نوترکیب……………………………………42

2-20- استخراج پلاسمید در مقیاس کم ……………………………………(Mini-Preparation)43

2-21- توالی‏یابی………………………………………………………………………………43

2-22- انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با‏ استفاده از روش ذوب و انجماد…………………………………………………………………43

فصل سوم: نتیجه‏گیری و بحث

3- شناسایی باکتری Xcc (A*)……………………………………………………………………………………………………………………..47

3-1-  شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه میزبان C.auratifolia…………………………………47

3-2-  شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصیMS+/MS-  و Xac01 / Xac02……………………………….48

3-3-  استخراج DNA ژنومی از باکتری XCC……………………………………………………………………………49

3-4-  تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده………………………………………………50

3-5- تکثیر ژن‏هایhrpW  و hrpG با واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………….51

3-5-1-  طراحی آغازگرهای مناسب……………………………………………………………51

3-5-2-  بهینه‏سازی شرایط واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………51

3-5-3-  الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….53

3-6-  تایید ناقل‏های کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیم‏های برشی نوع II…………………………………………………………………………………………………………………………………….54

3-7-  همسانه‏سازی ژن‏هایhrpG  و hrpW در ناقل‏های کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19)………….55

3-8-  تایید همسانه‏سازی ژن‏های هدف در ناقل‏های کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)………………57

3-8-1-  واکنش کلونی PCR کلون‏های گزینش شده……………………………………………57

3-8-2-  تایید همسانه‏سازی ژن‏هایhrpW/G  در ناقل‏های کلونینگ با روش هضم آنزیمی…………58

3-8-3-  تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………………………………………………………59

3-9- همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121………………………………………………………59

3-10- تایید همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121…………………………………………….62

3-10-1- واکنش کلونی PCR کلون‏های تشکیل شده……………………………………………62

3-10-2- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.63

3-10-3- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………….64

3-11- توالی‏یابی……………………………………………………………………………..65

3-11-1- نتایج توالی‏یابی……………………………………………………………………..66

3-12- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس.67

3-13- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس……..67

3-13-1- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR…………………………..67

فصل چهارم: جمع‏بندی کلی و پیشنهادها

4- جمع‏بندی کلی نتایج……………………………………………………………………….70

4-1- پیشنهادها………………………………………………………………………………71

پیوست

5- دستورالعمل استخراج و خالص‏سازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه 088(A*) NIGEB-……………………………………………………………………………………………………………………………………84

5-1-  محلول‏های لازم جهت استخراج DNA ژنومی……………………………………………84

5-1-1- مراحل استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………85

5-1-2- روش اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………86

5-1-3- الکتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………….87

6- الکتروفورز با ژل آگارز……………………………………………………………………………………. 88

6-1- نمای ساده از دستگاه الكتروفورز…………………………………………………………88

6-2- ژل آگارز……………………………………………………………………………….89

6-3- اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………….89

6-4- بافر بارگزاری ژل آگارز………………………………………………………………….90

6-5- طرز تهیه محلول …………………………………………………………….TBE 0.5X91

6-6- طرز تهیه آگارز 1%……………………………………………………………………………………………..91

7- دستورالعمل خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز…………………92

7-1- خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده با کیت ……………………………………..Bioneer92

7-2- خالص‏سازی قطعات DNA از ژل آگارز……………………………………………………………………………93

8- دستورالعمل تهیه باكتری‏های مستعد برای پذیرش DNA

 

خارجی…………………………………….95

8-1- تهیه سلول‏های مستعد E.coli……………………………………………………………………………95

8-2- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی………………………………………………96

8-3- تهیه‏ی سلول‏های مستعد و انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و  pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با بهره گرفتن از روش ذوب و انجماد……………………………………………………….97

9- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α……………………………………………..99

9-1- استخراج پلاسمید به روش دستی…………………………………………………………99

9-2- استخراج پلاسمید با بهره گرفتن از کیت MBST (دکتر شایان)…………………………………….101

9-3- روش تهیه محلول های IPTG و …………………………………………………X-Gal103

9-3-1- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)…………………………………………….103

9-3-2- تهیه 5 برمو-3 کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)………………………………103

10- تهیه مایه تلقیح و بهینه‏سازی شرایط مایه‏زنی گیاه میزبان……………………………………………………..103

 

فهرست جداول

1-1- بیماریزایی فرم‏های مختلف شانکر روی چهار گونه از مرکبات………………………………….       12

1-2- مشخصات آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر و شناسایی………………………………………….     29

2-2- برنامه Multipelex PCR با آغازگر‏های MS+/MS-  و Xac01/Xac02………………………          30

3-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش Multipelex PCR جهت شناسایی باکتری…………….         30

4-2- شیب‏ دمایی به‏کار رفته برای تعیین بهترین دمای اتصال با آنزیم Taq………………………….       32

5-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز……….         32

6-2- چرخه حرارتی به‏کار ‏رفته برای تکثیر نهایی با آنزیم pfu………………………………………….      33

7-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pGEM7zf(-))…………….          36

8-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pUC19)……………………..        36

9-2- شرایط واکنش دوتایی هضم آنزیمی جهت تایید ناقل‏های همسانه‏سازی ((-)pGEM7zf) و (pUC19)……………………………………………………………………………………………………………..     37

10-2– شرایط واکنش هضم دوتایی آنزیمی جهت تایید ناقل بیانی(pBI121)……………………..        37

11-2- شرایط واکنش هضم آنزیمی ژن hrpW و pBI121 جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل……………………………………………………………………………………………………………………….    38

12-2– شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل بیانی جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل…………………………………………………………………………………………………………………………. 38

13-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpG)…………………………………………………………..         40

14-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpW)……………………………………………………………       40

15-2- شرایط واکنش اتصال (pUC19-hrpG)…………………………………………………………….        41

16-2- شرایط واکنش اتصال (pGEM7zf(-)-hrpW)……………………………………………………         41

17-2- چرخه حرارتی به‏کار رفته برای واکنش کلونی PCR به منظور تایید همسانه‏سازی در وکتور بیانی……………………………………………………………………………………………………………………..   45

18-2- ترکیبات محلول مادری واکنش زنجیره‏ای کلونی PCR جهت تایید عمل همسانه‏سازی دروکتورهای کلونینگ و بیانی……………………………………………………………………………………     45

1-5- مواد و مقدار مورد نیاز جهت تهیه بافر Loading dye………………………………………………     9

فهرست شکل‏ها

1-3- تست بیماریزایی روی لیمو………………………………………………………………………………………………48

2-3- تست (Xaco1 / Xaco2 / MS+/MS) Multiplex PCR……………………………………………………..49

3-3- اکتروفورزDNA ژنومی استخراج شده بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………..50

4-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با Taq دی.ان.آ پلیمراز و گرادیان دمایی جهت بهینه‏سازی بهترین دمای اتصال با پرایمرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………………….53

5-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای تکثیر ژن‏های hrpG , hrpW با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز………………………………………………………………………………………………………………………..53

6-3- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگ و بیانی با آنزیم‏های برشی نوع II بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………………………………………………………………………………………..54

7-3- هضم آنزیمی فراورده ژن‏هایhrpG  و hrpW جهت بازیابی از روی ژل آگارز)الف) و قطعات بازیابی شده(ب)………………………………………………………………………………………………………………………55

8-3- هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگpUC19  و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز(الف) قطعات بازیابی شده(ب)……………………………………………………………………………………………………………………..55

9-3- واکنش کلونی PCR برای کلون‏های سفید حاصل ازhrpG  و hrpW……………………………………58

10-3- هضم آنزیمی پلاسمیدهای استخراج شده از کلونی‏های حاصل از واکنش اتصال pGEM و hrpw و همچنینhrpG  و pUC19……………………………………………………………………………………………………..58

11-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز پلاسمیدهای تایید شده بر روی ژل آگارز 1%….59

12-3- هضم آنزیمی ناقل بیانی جهت بازیابی از روی ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)……..61

13-3- فراورده بازیابی شده ناقل بیانی و ژن‏های hrpW/G جهت تعیین نسبت واکنش اتصال…………..62

14-3-  واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از مخلوط اتصال وکتور pBI121 و ژن‏های hrpG و hrpW……………………………………………………………………………………………………………………….63

15-3- هضم آنزیمی دوتایی پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG  و pBI.hrpW با آنزیم‏هایXbaI/BamHI XbaI/SacI……………………………………………………………………………………………………………………………..64

16-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG  و pBI.hrpW جهت بررسی حضور ژن‏های مذکور……………………………………………………………………………………………………………..65

17-3- پلاسمیدهای نوترکیب استخراج شده……………………………………………………………………………..66

18-3- واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G  به          سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس…………………………………………………………………………………………. 68

چکیده

بیماری شانکر به‏وسیله‏ی باکتری (Xanthomonas  citri pv. citri) ایجاد می‏شود که هر ساله عملکرد و کیفیت محصولات خانواده مرکبات، به‏ویژه لیمو‏ترش و پرتقال را تحت تاثیر خود کاهش می‏دهد. این پژوهش با هدف جداسازی و همسانه‏سازی دو ژن رمز کننده‏ی هارپین‏های HrpW و HrpG از باکتری Xcc سویه NIGEB-088 و ساخت پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpG و pBI-hrpW به‏منظور توسعه‏ی استراتژی مقاومت به بیماری شانکر بر مبنای القای واکنش دفاعی در گیاه لیموترش انجام شد. بدین منظور آغازگرهای اختصاصی (رفت و برگشت) برای تکثیر این ژن‏ها با بهره گرفتن از توالی کامل DNA ژنومی باکتری عامل این بیماری، طراحی شد. ژن‏های تکثیر شده سپس به منظور همسانه‏سازی، در پلاسمید‏های pGEM7zf(-) و همچنین pUC19 به ترتیب برای ژن‏های hrpW و hrpG،  با جایگاه‏های برشی XbaI و SacI و همچنین XbaI وBamHI وارد شد و پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری E.coli سویه DH5α تراریخت شدند. به منظور بیان ژن‏ها در گیاه، قطعه‏ی مورد نظر در ناقل pBI121 و در جایگاه‏های برشی برای ژن‏های هدف همسانه‏سازی شد، به‏طوری ‏که ژن‏های مورد نظر تحت کنترل پیشبر ویروس موزائیک گل کلم 35S و پایان‏بر NOS در ناحیه‏ی  DNA T- این ناقل

استاد راهنما:
دکتر مهدی حسن‌شاهیان
استاد مشاور:
دکتر سید محمد‌‌رضا خوشرو
 

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب:

چکیده………………………………………………………………………. 1

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه………………………………………………………………… 3

1-2- بیان مسئله…………………………………………………………. 4

1-3- اهمیت و ضرورت انجام تحقیق……………………………………. 5

1-4- ادبیات تحقیق………………………………………………………. 6

1-5- اهداف تحقیق……………………………………………………… 10

1-5-1 اهدف کلی……………………………………………………….. 10

1-5-2 اهداف جزئی…………………………………………………….. 10

1-5-3 اهداف کاربردی………………………………………………….. 11

1-6- سؤالات تحقیق…………………………………………………… 11

فصل دوم: مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1- خلیج فارس……………………………………………………….. 13

2-2- استان بوشهر…………………………………………………….. 14

2-3- نفت و آلودگی‌های نفتی………………………………………… 15

2-4- ورود نفت به آب دریا………………………………………………. 17

2-5- تغییرات نفت پس از ورود به آب دریا…………………………….. 17

2-5-1 پراکنده شدن…………………………………………………….. 18

2-5-2 پخش شدن مواد نفتی در سطح آب………………………….. 18

2-5-3 حل شدن………………………………………………………… 18

2-5-4 تبخیر شدن……………………………………………………… 18

2-5-5 اکسیداسیون فتوشیمیایی……………………………………. 18

2-5-6 بحالت امولسیون در آمدن…………………………………….. 19

2-5-7 قابلیت تجزیه زیستی………………………………………….. 19

2-5-8 ته نشین شدن………………………………………………… 19

2-6- تجزیه‌زیستی………………………………………………………20

2-7- معرفی هیدروکربن‌های آروماتیک………………………………. 20

2-7-1 طبقه‌بندی ترکیبات آروماتیک…………………………………. 20

2-7-2 فرمولاسیون ترکیبات آروماتیک……………………………….. 21

2-7-3 خواص فیزیکی و شیمیایی…………………………………… 22

2-7-4 درجه سمیت ترکیبات آروماتیک……………………………… 23

2-7-5 اثرات هیدروکربن‌های پلی‌آروماتیک روی سلامتی انسان‌ها و موجودات زنده….27

2-7-6 هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک و سرطان……….. 27

2-7-7 چه عاملی ترکیب را سرطان‌زا می‌کند؟……………………. 27

2-8- فنل……………………………………………………………….. 28

2-8-1 کلیات ترکیب فنل………………………………………………. 28

2-8-2 نام‌گذاری……………………………………………………….. 28

2-8-3 فنول‌های طبیعی……………………………………………… 29

2-8-4 ساختمان مولکولی و خواص فیزیکی………………………. 29

2-8-5 خواص فیزیکی………………………………………………… 29

2-8-6 تأثیر فنل بر محیط زیست و موجودات زنده…………………..30

2-8-7 کاربردها………………………………………………………… 30

2-9- تجزیه‌زیستی……………………………………………………. 30

2-9-1 روش‌های پاکسازی بیولوژیکی…………………………….. 31

2-9-2 مبانی زیست‌درمانی…………………………………………. 32

2-9-3 میکروارگانیسم‌های هوازی…………………………………… 32

2-9-4 میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی………………………………. 32

2-9-5 مخمرها و قارچ‌ها……………………………………………… 33

2-9-6 استفاده از بیوراکتور‌ها……………………………………….. 33

2-9-7 کو‌متابولیسم………………………………………………….. 34

2-9-8 دی‌نیتریفیکاسیون……………………………………………..34

2-9-9 کمپوست کردن……………………………………………….. 34

2-9-10 درمان بیولوژیکی……………………………………………. 34

2-10- میکروارگانیسم های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک……….35

2-11- مسیر های تجزیه زیستی………………………………….. 36

2-11-1 تجزیه میکروبی فنل…………………………………………. 36

2-11-2 تجزیه میکروبی نفتالین…………………………………….. 39

فصل سوم: روش شناسی تحقیق

3-1- محیط کشت‌های مورد استفاده……………………………… 44

3-1-1 محیط ONR7a………………………………………………….

3-1-2 محیط (ONR7a + نفتالین) آگار………………………………. 45

3-1-3 محیط) +ONR7a فنل( آگار……………………………………. 45

3-1-4 محیط مارین براث (MB)……………………………………….. 45

3-1-5 محیط مارین آگار (MA)………………………………………… 46

3-1-6 محیط نوترینت براث (NB)……………………………………… 46

3-1-7 محیط نوترینت آگار (NA)……………………………………… 46

3-2- محلول‌ها………………………………………………………… 47

3-2-1 سرم فیزیولوژی……………………………………………….. 47

3-2-2 محلول اتیلن‌دی‌‌آمینو‌تترا‌استیک‌اسید (EDTA)…………….. 47

3-2-3 محلول Tris-Base……………………………………………..

3-2-4 محلول TBE……………………………………………………

3-2-5 محلول   EDTA Tris-Base- (TE)……………………………

3-2-6 محلول اتیدیوم بروماید……………………………………….. 48

3-3- مواد مصرف شده در PCR……………………………………..

3-4- دستگاه‌های مورد استفاده……………………………………. 49

3-5- روش عملی…………………………………………………….. 50

3-5-1 نمونه برداری به منظور جداسازی باکتری های تجزیه کننده…50

3-5-2 شمارش باکتری های موجود در محیط…………………….. 51

3-5-2-1 شمارش باکتری های هتروتروف………………………….. 51

3-5-2-2 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده نفتالین……………….. 51

3-5-2-3 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل……………………. 51

3-5-3 جداسازی باکتری های تجزیه کننده………………………… 51

3-5-3-1 جداسازی و غربالگری باکتری های  تجزیه کننده………..51

3-5-3-2 تست های تکمیلی………………………………………. 52

3-5-3-2-1 سنجش رشد باکتری………………………………….. 52

3-5-3-2-2 فعالیت امولسیون‌کنندگی (E24)……………………… 52

3-5-3-2-3  سنجش حذف فنل…………………………………….. 52

3-5-3-2-4 سنجش حذف نفتالین………………………………….. 52

3-5-4 شناسایی باکتری ها………………………………………… 53

3-5-4-1 استخراج DNA ژنومی با روش فنل کلروفورم……………. 53

3-5-4-2 تعیین غلظت DNA استخراج شده……………………….. 54

3-5-4-3 برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR……………….

3-5-4-4 بررسی محصول PCR……………………………………….

3-5-4-5BLAST  کردن نتایج حاصل از توالی یابی نوکلئوتیدی نمونه ها…..55

 فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق

4-1- نمونه برداری………………………………………………….. 57

4-2- شمارش باکتری ها…………………………………………… 58

4-2-1 شمارش تعداد کل هتروتروف‌ها……………………………. 58

4-2-2 شمارش تعداد کل تجزیه کننده‌ها…………………………. 60

4-3- نکات ایمنی جهت استفاده از فنل و نفتالین……………… 61

4-4- جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده……………… 62

 

4-4-1 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه فنل جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل…..62

4-4-2 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه نفتالین جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده نفتالین…..62

4-5- تست‌های تکمیلی جهت انتخاب باکتری‌هایی با توان بالای تجزیه فنل و نفتالین…..63

4-5-1 سنجش میزان رشد باکتری های تجزیه کننده فنل و نفتالین…63

4-5-2 فعالیت امولسیون کنندگی (E24)……………………… 67

4-5-3 سنجش حذف ترکیبات آروماتیک……………………….. 71

4-5-3-1 سنجش حذف نفتالین………………………………… 71

4-5-3-2 سنجش حذف فنل……………………………………… 73

4-6- شناسایی مولکولی نمونه های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک….75

4-6-1 بررسی محصول PCR………………………………………

4-6-2 BLAST کردن توالی نوکلئوتیدی نمونه ها……………….. 76

4-7- رسم درخت فیلوژنی برای سویه‌ها………………………… 92

4-8- فاصله ژنتیکی بین سویه‌ها………………………………… 94

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- بحث و نتیجه گیری…………………………………………… 97

5-2- پیشنهادات……………………………………………………. 100

منابع و مآخذ………………………………………………………… 101

فهرست منابع فارسی…………………………………………….. 101

فهرست منابع انگلیسی………………………………………….. 103

چکیده انگلیسی……………………………………………………. 108

چکیده:

ترکیبات آروماتیک, جز آلاینده‌های نفتی بوده که در ساختمان مولکولی آن‌ها حلقه‌های بنزنی بکار رفته و به لحاظ پایداری در محیط‌های آبی از اهمیت خاصی برخوردار هستند. از آنجا که این ترکیبات بعنوان آلاینده‌های مهم در فهرست سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا آمده‌اند و از طرفی که سال 2013 بعنوان سال جهانی حفاظت از محیط زیست نامگذاری شده است و در دهه‌های اخیر به دلایل مختلف آلودگی آب خلیج‌فارس بعنوان یک محیط بسته دریایی به این ترکیبات افزایش یافته است. هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک از نوار ساحلی استان بوشهر در خلیج‌فارس است. یکی از روش‌های کاهش آلاینده‌های مختلف, روش بیولوژیک و استفاده از میکروارگانیسم ها جهت پاکسازی این‌گونه آلاینده‌ها است. در این مطالعه تعداد 25 نمونه آب, 6 نمونه خاک و 4 آب و خاک از نقاط مختلف با پراکنش مشخص از نوار ساحلی استان بوشهر جمع آوری گردید نمونه‌ها به محیط اختصاصی ONR7a منتقل شد, سپس در محیط نوترینت آگار کشت داده شده و بر باکتری‌های جدا شده تست‌های میزان رشد و فعالیت امولسیون کنندگی (E24) و سنجش حذف برای بررسی میزان تجزیه فنل و نفتالین انجام شد. از باکتری‌های جدا شده جهت تشخیص مولکولی, جداسازی DNA انجام شد, سپس توسط پرایمر‌های Uni_1492R و Bac 27_F مورد PCR قرار گرفت و در نهایت تعداد 9 باکتری به عنوان تجزیه کننده فنل و نفتالین معرفی شدند. نتایج این تحقیق به وجود آلودگی به فنل و نفتالین در نوار ساحلی استان بوشهر و تفکیک منطقه‌ای هر باکتری انجامید. سپس با توجه به رسم درخت فیلوژنی و بررسی فاصله بین نمونه‌ها از صحت نتایج اطمینان حاصل شد.

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه

خلیج‌فارس به دلیل شرایط اقلیمی ویژه‌ی حاکم بر آن بسیار شکننده و آسیب‌پذیر است و ورود کمترین آلاینده‌ها به داخل دریا اثرات مخربی بر سلامت آبزیان و موجودات آن دارد. خلیج‌فارس با تمام مشکلات محیطی و اقلیمی که بر آن حاکم است از تنوع ژنی بالایی برخوردار است. از طرفی خلیج‌فارس محل حمل و نقل جهانی محسوب می‌شود و این امر موجب شده در سال‌های گذشته لکه‌های نفتی بسیاری از این نفت‌کش‌ها در آب‌های خلیج‌فارس به جا بماند, از طرفی آلاینده‌های صنایع حاشیه سواحل وارد آب این دریا         می‌شوند و همچنین بخشی از آلاینده‌ها بر اثر حرکت نفت‌کش‌ها و شناورها, رها کردن آب توازن کشتی‌ها- حفاری و عملیات کشف نفت- تراوش و استخراج نفت و ریختن زباله‌ها از داخل شناور‌ها به خلیج‌فارس تزریق می‌شوند. مرجان‌های زیبا و گونه‌های نادر گیاهی و جانوری در حالی قربانی توسعه بی رویه غیر اصولی و هجوم انواع آلاینده‌ها به درون دریا می‌شوند که هنوز سازمان حفاظت از محیط زیست به عنوان دستگاه متولی حفظ محیط زیست نتوانسته اقدام موثر و شایسته‌ای در این زمینه انجام دهد. که در نهایت اینگونه بی‌توجهی‌ها منجر به مرگ و میر آبزیان و مهاجرت آن‌ها به خارج از منطقه, تغییرات در تنوع زیستی و کاهش تنوع زیستی و تغییر رفتار موجودات در محیط زیست منطقه می‌شود که از جمله آثار ناشی از آن آلودگی دریاهاست.

بخش اعظم آلاینده‌های موجود در خلیج‌فارس از نوع نفتی است, از طرفی نفت از میلیون‌ها ترکیب تشکیل شده است که در کل می‌توان آن‌ها را در 4 دسته تقسیم‌بندی کرد که عبارتند از ترکیبات آروماتیک, هیدروکربن‌های اشباع, رزین‌ها و آسفالتن‌ها. از طرفی ترکیبات آروماتیک با توجه به تعداد حلقه‌های بنزنی به کار رفته در ساختارشان تقسیم‌بندی می‌شوند که در این پروژه از فنل بعنوان یک ترکیب آروماتیک تک حلقه و از نفتالین بعنوان یک ترکیب دو حلقه استفاده شده است. ترکیبات آروماتیک از طریق استنشاق, بلعیدن و تماس مستقیم با پوست قابلیت ورود به بدن داشته و در صورت بروز این رخداد منجر به بروز علایمی چون استفراغ, سرگیجه و اسهال می‌شود و با توجه به خصوصیات شیمیایی که دارا می‌باشند, توانایی ایجاد جهش در ژنوم موجودات زنده را دارند و می‌تواند منجر به بروز سرطان در موجود زنده شوند. در این پروژه با بررسی آلودگی منطقه ساحلی استان بوشهر به ترکیبات آروماتیک موفق به جداسازی و شناسایی 9 سویه تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک شده و با رسم درخت فیلوژنی به بررسی جد مشترک میکروارگانیسم‌ها پرداخته‌ایم. بطور کلی این پایان ‌نامه از 5 فصل تشکیل شده است که عبارتند از فصل اول شامل کلیه قسمت‌های مربوط به پروپوزال جهت بیان مسئله و ارائه ضروریات اجرایی شدن مسئله و اهداف پروژه. فصل دوم مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق. فصل سوم شامل روش اجرای تحقیق می‌باشد.در فصل چهارم به تجزیه و تحلیل داده‌ها پرداخته ودر نهایت در فصل پایانی به بحث و نتیجه‌گیری و بیان پیشنهادات می‌پردازیم.

2-1- بیان مسئله

تجزیه زیستی مواد، به فرایندی اطلاق می‌شود که در طی آن مواد آلوده‌کننده خارجی به وسیله میکروارگانیسم‌هایی که قادرند از آنها استفاده کنند، به مواد بی‌ضرر تبدیل می‌شوند (Luis and Mara et al 2000, 69-75; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496). که در آن از میکروب‌های مختلف استفاده می‌شود و اساس کار آن استفاده از جمعیت‌های میکروبی به منظور تجزیه آلاینده‌ها بوده بنابراین ضرورت نظافت زیستگاه‌های طبیعی جمعیت‌های میکروبی قبل از هر کار دیگر لازم و ضروری می‌باشد (Aitken and Stringfellow et al 1998, 743-752). آلودگی نفتی از معضلات زیست محیطی می‌باشد، هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46) نفت‌خام کمپلکس پیچیده‌ای از مخلوط صد‌ها نوع ترکیب مختلف شامل هیدروکربن‌ها, نیتروژن, گوگرد و وانادیوم است که قسمت هیدروکربن شامل ترکیبات آروماتیک, آلیفاتیک و آسفالتی است (Sisler and Zobell 1987, 521-522; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496; Feijoo-Siota and Rosa-Dos- Santos 2008, 185-192) ورود هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه‌ای PAHs[1] به محیط زیست, اثرات بسیار خطرناکی در زندگی انسان خواهد داشت. مشخص شده است که PAH ها عوامل بالقوه سرطان‌زا برای انسان می‌باشند و به سرعت وارد بدن شده و در بافت‌های چربی بدن ذخیره می‌شوند (Koch and Fuchs 1992, 649-671). هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46). این آلاینده‌ها یکی از مهمترین آلودگی‌های زیست محیطی دنیا محسوب می‌شود که در اثر دفع و دور ریز نامناسب فاضلاب‌ها، ضایعات، پساب صنعتی و

تور مسافرتی تور هند تور ترکیه تور تایلند تور دبی طراحی سایت تور ترکیه ساندویچ پانل تور چین رپرتاژ آگهیاقامت گرجستان بازاریابی ویروسی
جستجو برای:
جستجو …
کلمات کلیدی بیشتر جستجو شده :
فیزیولوژیکیکاهش ارزشمشاور خارجیولی خاصمولفه های سازمانیشکاف نیازها و خواسته های مشتریان

 

گرایش میکروبیولوژی
 
عنوان
جداسازی هم زمان ژن‏های عامل مقاومت افزایش یافته به آمینوگلیکوزیدهاaac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia ، ant(4)-Іa،aph(3ʹ)-IIIa  در انتروکوک های ایزوله شده از بیماران شهر تهران با روش مولکولی Triplex-PCR
 
استاد راهنما
دکتر رضا میرنژاد
 
دی‏ماه 93
 

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                        صفحه

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 1

فصل اول – مقدمه

1-1- بیان مسأله………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-2- ضرورت انجام تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………. 3

1-3-اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-4-فرضیه‏ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 4

1-5-تعریف واژه‏ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 4

فصل دوم – مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1-تاریخچه باکتری انتروکوک………………………………………………………………………………………………………………………….. 5

2-2-تاکسونومی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 7

2-3-فاکتورهای بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………….. 8

2-3-1-مواد تجمعی…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 9

2-3-2-سیتولیزین………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 9

2-3-3-ژلاتیناز………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-3-4-فرمون………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 10

2-3-5-لیپوتیکوئیک اسید………………………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-3-6-همولیزین انتروکوکوس فکالیس…………………………………………………………………………………………………………… 11

2-3-7-آنتی ژن آندوکاردیتی انتروکوکوس فکالیس…………………………………………………………………………………………… 11

2-3-8-پروتئین سطحی انتروکوکی (ESP )……………………………………………………………………………………………………… 11

2-3-9-ادهسین کلاژن انتروکوکوس فکالیس (ACE )………………………………………………………………………………………. 12

2-4-بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12

2-4-1-باکتریمی……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12

2-4-2-عفونت های مجاری ادراری…………………………………………………………………………………………………………………. 13

2-4-3-اندوکاردیت…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 13

2-4-4-عفونت های داخل شکمی، لگنی وبافت های نرم………………………………………………………………………………….. 13

2-4-5-سایر عفونت های انتروکوکی……………………………………………………………………………………………………………….. 14

2-5-شناسایی انترکوک‏ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 14

2-6-درمان انترکوک‏ها………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

2-6-1-مقاومت آنتی بیوتیکی…………………………………………………………………………………………………………………………… 16

2-6-1-1-مقاومت به گلیکوپپتیدها………………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-6-1-1-الف- عوامل زمینه ساز کلنیزاسیون انتروکوک های مقاوم به ونکومایسین(VRE)……………………………… 17

2-6-1-2-مقاومت به آنتی بیوتیک های بتالاکتام……………………………………………………………………………………………… 19

2-6-1-3-مقاومت به آنتی بیوتیک های تتراسایکلین……………………………………………………………………………………….. 20

2-6-1-4-مقاومت به لینکوزامیدها………………………………………………………………………………………………………………….. 20

2-6-1-5-مقاومت به استرپتوگرامین B وA……………………………………………………………………………………………………… 21

2-6-1-6-مقاومت به اگزازولیدون…………………………………………………………………………………………………………………… 21

2-6-1-7-مقاومت به اورنی مایسین………………………………………………………………………………………………………………… 22

2-6-1-8-مقاومت در برابر آنتی بیوتیک های ماکرولیدی…………………………………………………………………………………. 22

2-6-1-9-مقاومت به کلرامفنیکل…………………………………………………………………………………………………………………….. 23

2-6-1-10-مقاومت به آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………………………. 24

2-6-1-10-الف- تاریخچه روند گسترش مقاومت های آمینوگلیکوزیدی……………………………………………………….. 25

2-6-1-10-ب- انواع مقاومت به آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………. 25

2-6-1-10-پ- اهمیت مقاومت آمینوگلیکوزیدی………………………………………………………………………………………….. 27

2-6-1-10-ت-HLAR و و افزایش مرگ ومیر……………………………………………………………………………………………….. 28

2-6-2-مقاومت چنددارویی( MDR)……………………………………………………………………………………………………………….. 28

2-7- روش های شناسایی سویه های مقاوم به آنتی بیوتیک……………………………………………………………………………….. 29

2-7-1- روش های مبتنی بر فنوتیپ………………………………………………………………………………………………………………… 29

 

2-7-1-1- روش انتشار دیسک در آگار( دیسک دیفیوژن)……………………………………………………………………………….. 29

2-7-1-2- روش تهیه رقت در محیط مایع( براث دیلوشن )…………………………………………………………………………….. 30

2-7-1-3 – روش تهیه رقت در محیط آگار( آگار دیلوشن )…………………………………………………………………………….. 30

2-7-2- روش های مبتنی بر ژنوتیپ………………………………………………………………………………………………………………… 31

2-7-2-1-Triplex-PCR……………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-7-2-1-الف-طراحی واجرایTriplex-PCR……………………………………………………………………………………………….. 32

2-7-2-1-ب-تیتراسیون اجزای واکنش………………………………………………………………………………………………………….. 33

2-7-2-1-3 -شرایط ترموسایکلر……………………………………………………………………………………………………………………. 33

2-8-اپیدمیولوژی عفونت های انتروکوکی…………………………………………………………………………………………………………. 33

2-9-مروری بر پیشینه پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………….. 35

فصل سوم – مواد و روش‏ها

3-1-وسایل موردنیاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 40

3-2-مواد موردنیاز……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 41

3-3-طریقه ساخت محیط های کشت………………………………………………………………………………………………………………… 43

3-3-1-محیط بلادآگار…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

3-3-2-محیط BHI براث…………………………………………………………………………………………………………………………………. 43

3-3-3-محیط مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

3-3-4-محیط پایه قند……………………………………………………………………………………………………………………………………… 44

3-4-جمع آوری نمونه……………………………………………………………………………………………………………………………………… 45

3-5-جدا سازی سویه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 45

3-6-نگهداری سویه ها……………………………………………………………………………………………………………………………………… 46

3-7-آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 46

3-7-1-تهیه سوسپانسیون باکتریایی………………………………………………………………………………………………………………….. 46

3-7-2-روش آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………………………………………….. 47

3-8-بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین……………………………………………………………………. 48

3-9-اجرای PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 48

3-9-1-آماده سازی واستخراج ژنوم………………………………………………………………………………………………………………….. 48

3-9-1-1-جوشاندن………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49

3-10-اندازه گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده……………………………………………………………………………………. 49

3-11-الکتروفورز محصول استخراج ژنوم…………………………………………………………………………………………………………. 50

3-12-انتخاب و سنتز پرایمر…………………………………………………………………………………………………………………………….. 50

3-13-روش آماده سازی پرایمرها……………………………………………………………………………………………………………………… 51

3-13-1-محلول کاری پرایمر PCR…………………………………………………………………………………………………………………. 51

3-13-2- ترکیب واکنش PCR برای هر نمونه…………………………………………………………………………………………………. 52

3-14-انجام واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………………………………………. 52

3-15-طریقه ساخت بافر…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-15-1-تهیه بافر(SX )TBE…………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-15-2-تهیه ژل Buffer  Loading  Gel……………………………………………………………………………………………………. 54

3-16-تهیه ژل الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………… 55

3-16-1-تهیه‌ی ژل آگاروز جهت انجام الکتروفورز  ژنوم اسنخراج شده و محصول PCR…………………………………. 55

3-17-تعیین توالی……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 55

فصل چهارم – نتایج و بحث

4-1-نتایج مربوط به جداسازی گونه های انتروکوکی از نمونه های بالینی………………………………………………………….. 56

4-2-نتایج حاصل از کشت انتروکوک ها بر روی محیط و رنگ آمیزی گرم……………………………………………………….. 57

4-3-نتایج حاصل از حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن………………………………………………………………. 61

4-4-نتایج حاصل از استخراج…………………………………………………………………………………………………………………………… 61

4-5-نتایج PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

4-6-بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 66

فصل پنجم – نتیجه‏گیری

5-1- نتیجه‏گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 71

5-2-پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 72

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 73

منابع غیرفارسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 73

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 84

فهرست جدول‏ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

جدول(3-1) اجزای تشکیل دهنده محیط بلاد آگار…………………………………………………………………………………………….. 43

جدول(3-2) اجزای تشکیل دهنده ی محیط BHI براث……………………………………………………………………………………… 43

جدول(3-3) اجزای تشکیل دهنده محیط مولر هینتون آگار………………………………………………………………………………… 44

جدول(3-4) اجزای تشکیل دهنده محیط پایه قند………………………………………………………………………………………………. 44

جدول(3-5) مشخصات دیسک های آنتی بیوتیکی استفاده شده………………………………………………………………………….. 48

جدول(3-6) پرایمرهای استفاده شده برای پیدا کردن به سویه های انتروکوکی مقاوم به آمینوگلیکوزیدی…………….. 50

جدول( 3-7)محلول کاری جهت پرایمر  aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia………………………………………………………………….. 51

جدول( 3-8 )محلول کاری جهت پرایمر  aph(3ʹ)-IIIa……………………………………………………………………………………. 51

جدول (3-9 )محلول کاری جهت پرایمر  ant(4)-Іa………………………………………………………………………………………… 51

جدول( 3-10) محلول کاری جهت PCR…………………………………………………………………………………………………………… 52

جدول(3-11) برنامه PCR  بهینه سازی شده برای جفت پرایمر aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia……………………………….. 53

جدول(3-12)برنامه PCR  بهینه سازی شده برای جفت پرایمر aph(3ʹ)-IIIa……………………………………………………. 53

جدول(3-13) برنامه PCR  بهینه سازی شده برای جفت پرایمر ant(4)-Іa……………………………………………………….. 54

جدول( 3-14) اجزای تشکیل دهنده بافر TBE………………………………………………………………………………………………….. 54

جدول(3-15) اجزای تشکیل دهنده ژل لودینگ بافر………………………………………………………………………………………….. 53

جدول( 4-1) درصد فروانی انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم در نمونه های بالینی…………………………… 60

جدول(4-2) درصدفراوانی سویه های انتروکوک  حاوی یک ژن در نمونه های بالینی…………………………………………. 64

جدول(4-3) درصدفراوانی سویه های انتروکوک حاوی بیش از یک ژن در نمونه های بالینی………………………………. 66

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                        صفحه

نمودار(4-1) درصد فراوانی انتروکوک های جداسازی شده از نمونه های بالینی………………………………………………….. 57

نمودار(4-2) نتایج حاصل از روش دیسک دیفیوژن برای تمام ایزوله های انتروکوکی…………………………………………. 61

فهرست شکل‏ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

شکل( 4-1) کشت در محیط5/6 درصد BHI Broth Nacl……………………………………………………………………………… 57

شکل(4-2) کشت روی محیط بلاد آگار ……………………………………………………………………………………………………………. 58

شکل(4-3 )رنگ آمیزی گرم انتروکوک و مشاهده توسط میکروسکوپ با بزرگنمایی 100X………………………………. 58

شکل(4-4) محیط کشت لاکتوز…………………………………………………………………………………………………………………………. 59

شکل(4-5) محیط کشت آرابینوز جهت افتراق دو گونه انتروکوک……………………………………………………………………… 59

شکل(4-6)  محیط کشت آرابینوز عدم رشد باکتری انتروکوکوس فکالیس………………………………………………………….. 60

شکل(4-7) الکتروفورز  نمونه‌های DNA  استخراج شده با روش جوشاندن بر روی ژل آگارز 1…………………………. 61

شکل(4-8) نتایج اندازه گیری غلظت DNA استخراجی با روش جوشاندن با دستگاه نانودراپ……………………………. 62

شکل(4-9) نتایج حاصل از الکتروفورز ژن aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia و aph(3ʹ)-IIIa…………………………………….. 63

شکل(4-10) نتایج حاصل از الکتروفورز از ژن ant(4)-l a……………………………………………………………………………….. 64

شکل(4-11) نتایج حاصل از الکتروفورز از ژن های مورد بررسی به روش Triplex-PCR…………………………………. 65

چکیده
انتروکوک ها جز فلور طبیعی دستگاه گوارش انسان می‏باشند و به عنوان یک پاتوژن فرصت طلب باعث عفونت های بیمارستانی به ویژه در بخش مراقبت های ویژه(ICU)  می گردد. این باکتریها به طور ذاتی یا با دریافت اجزا خارج ژنتیکی از طریق پلاسمید یا بر اثر موتاسیون های مختلف می توانند از خود مقاومت به آنتی بیوتیک های بتالاکتام و آمینوگلیکوزیدها نشان دهند. در انتروکوک ها ژن های  aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia aph(3′)-IIIa  و ant(4)-Іa نقش اصلی در پیدایش مقاومت نسبت به آمینوگلیکوزیدها را بازی می کنند. با توجه به اینکه در ایران میزان فراوانی ژن های فوق درانتروکوکوس فکالیس و فاسیوم مشخص نمی باشد این مطالعه با هدف بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia ،  ant(4)-Іa ، aph(3′)-IIIa در انتروکوک های ایزوله شده از بیماران شهر تهران اجرا می گردد. 350 نمونه بالینی مختلف در طی سال های 1393-1392 از  بیمارستان امام خمینی ، میلاد و بقیه ا…(عج) جمع آوری شد. تعیین هویت  هر ایزوله توسط  تست های بیوشیمیایی مشخص گردید. الگوی مقاومت دارویی با بهره گرفتن از دیسک های آنتی بیوتیکی جنتامایسین، استرپتومایسین و سایر آمینوگلیکوزیدها از روش دیسک دیفیوژن بر اساس معیار CLSI  انجام پذیرفت. پس از