دکتر محمود صالحی
استاد مشاور:
دکتر محمد خلیلی
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
خلاصه فارسی
دسته ای از سویه های اشریشیاکلی که قابلیت بیماری زایی در بلدرچین را ندارند اما از جنبه بهداشت عمومی با اهمیت تلقی می شوند سویه های تولید کننده شیگاتوکسین می باشند. هدف از این مطالعه شناسایی گروه و تحت گروه های فیلوژنی و تعیین حضور ژن های شیگاتوکسین و اینتیمین در جدایه های اشریشیاکلی از مدفوع از بلدرچین های سالم بوده است. در این مطلعه 235 نمونه مدفوع از بلدرچین سالم جمع آوری شده و متعاقبا جداسازی و تعیین هویت بیوشیمیایی سویه های اشریشیاکلی انجام گردید. از تمامی نمونه های اخذ شده از باکتری اشریشیاکلی جدا شد و اسیدنوکلئیک از جدایه ها استخراج گردید. جدایه های طی دو روش مولتی پلکس PCR مورد بررسی قرار گرفتند. بر اساس نتایج آزمایش PCR معلوم گردید که 235 جدایه مورد آزمایش در 4 گروه فیلوژنی انتشار دارند که بیشترین فراوانی مربوط به گروه A (55/62 درصد) و کمترین فراوانی مربوط به گروه B2 (90/8 درصد) بوده است. از طرف دیگر 9 جدایه (83/3 درصد) نسبت به یکی از ژن های stx1، stx2 و eae مثبت بوده اند. بیشترین فراوانی مربوط به ژن eae ( 13/2 درصد) بود همچنین 3 جدایه (28/1 درصد ) دارای ژن stx2 و یک جدایه (43/0 درصد ) نیز واجد ژن stx1 بود. نه جدایه ی (83/3 درصد) مثبت از نظر ژن های قابل بررسی در چهار گروه فیلوژنی A ، B1، B2 و D انتشار داشتند. تنها جدایه ی مثبت از نظر ژن stx1 در گروه فیلوژنی D قرار داشت سه جدایه ی مثبت از نظر ژن stx2 در دو گروه فیلوژنیD, A انشتار داشت. پنج جدایه ی مثبت از نظر ژن eae در چهار گروه فیلوژنی A ، B1، Dو B2 قرار اشتند از نظر آنتی بیوگرام بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به اکسی تتراسایکلین بود که 234 جدایه (57/99 درصد ) نسبت به این آنتی بیوتیک مقام بوده. بعد از تتراسایکلین بیشترین میزان مقاومت مربوط به آمپی سیلین بود که 160 جدایه (09/68 درصد) نسبت به این آنتی بیوتیک مقاوم بودند. کلمات کلیدی: اشریشیاکلی، بلدرچین ، شیگاتوکسین، فیلوژنی
فهرست مطالب
خلاصه فارسی………………………………………………………………………………………………….
فصل اول: مقدمه و هدف
مقدمه و هدف ……………………………………………………………………………………………….0
فصل دوم: کلیات و مروری بر منابع موجود
1-2- کلیاتی در مورد سویه های تولید کننده شیگاتوکسین ((STEC اشریشیاکلی………………….5
1-1-2- وروتوكسین ها یا توكسین های شبیه شیگا …………………………………………………………..5
2-1-2- ژنتیك وروتوكسین ………………………………………………………………………………………7
3-1-2- ساختمان وروتوكسین ها ………………………………………………………………………………….8
4-1-2- ناهمگونی سویه های تولید کننده شیگاتوکسین ………………………………………………….10
5-1-2- نامگذاری سویه های تولید کننده شیگاتوکسین …………………………………………………..11
6-1-2- اپیدمیولوژی پاتوتیپ تولید کننده شیگاتوکسین…………………………………………………..12
7-1-2- منابع انتشار سویه های تولید کننده شیگاتوکسین ………………………………………………….
15 2-2- کلیاتی در مورد بلدرچین ………………………………………………………………………..16
1-2-2- تاریخچه ……………………………………………………………………………………………………..17
2-2-2- شروع پرورش در جهان ……………………………………………………………………………….17
3-2-2- شروع پرورش در ایران ………………………………………………………………………………….18
4-2-2- جانور شناسی ……………………………………………………………………………………………….19
5-2-2- نژادهای بلدرچین ………………………………………………………………………………………….19
6-2-2- ویژگیهای عمومی بلدرچین …………………………………………………………………………….21
7-2-2- جنبه های اقتصادی………………………………………………………………………………………….24
8-2-2- نکاتی در مورد شروع صنعتی پرورش ……………………………………………………………….25
9-2-2- وسایل مورد نیاز برای نگهداری جوجه های بلدرچین …………………………………………28
10-2-2- تغذیه بلدرچین …………………………………………………………………………………………..30
11-2-2- فراوری و بسته بندی گوشت و تخم بلدرچین ها ……………………………………………..32
3-2- کلیاتی در مورد بیماری های بلدرچین ………………………………………………………………….34
1-3-2- کلی باسیلوز در بلدرچین و طیور ……………………………………………………………………..35
2-3-2- اشکال دیگر کلی باسیلوز در طیور …………………………………………………………………..41
3-3-2- بیماری نیوکاسل …………………………………………………………………………………………..42
4-3-2 -آنفلوانزا ……………………………………………………………………………………………………….45
5-3-2- برونشیت بلدرچین ………………………………………………………………………………………….46
6-3-2- بیماری آسپرژیلوز ………………………………………………………………………………………….50
فصل سوم: مواد و روش کار
1-3- مواد و وسایل مورد استفاده …………………………………………………………………………………54
2-3- روش‌کار ………………………………………………………………………………………………………..55
1-2-3- جمع آوری و تقسیم بندی نمونه‌ها ……………………………………………………………………55
2-2-3- كشت نمونه‌ها و جدا سازی اشریشیاکلی ……………………………………………………………55
3-2-3- تأیید نمونه‌های اشریشیاکلی …………………………………………………………………………..56
4-2-3- ذخیره نمونه‌ها ………………………………………………………………………………………………56
5-2-3- آزمایش PCR …………………………………………………………………………………………….57
1-5-2-3- استخراج DNA ………………………………………………………………………………………57
2-5-2-3- آزمایش PCR جهت شناسایی ژنهای کد کننده شیگا توکسین و انتیمین ……………57
3-5-2-3- آزمایش PCR جهت تعیین گروه و تحت گروه فیلوژنی …………………………………59
4-5-2-3- شناسایی و آنالیز محصولات PCR ……………………………………………………………..61
1-4-5-2-3- مراحل انجام الکتروفورز …………………………………………………………………………61
3-3- تعیین حساسیت آنتی‌بیوتیكی ………………………………………………………………………………64
فصل چهارم: نتایج
1-4- تعیین درصد جدایه های اشریشیاکلی در گروه های فیلوژنی …………………………………….67
2-4- انتشار جدایه ها از مدفوع بلدرچین در تحت گروه های فیلوژنی …………………………………68
3-4- نتیجه آزمایش PCR جهت شناسایی ژن های eae ، stx1 وstx2 ……………………………70
4-4- انتشار فیلوژنی جدایه های اشریشیاکلی مثبت از نظر stx1 ،eae و stx2 ……………………71
5-4- تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی جدایه ها …………………………………………………………………73
فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری
نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………….. 76
پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………..
منابع …………………………………………………………………………………………………………………….83
خلاصه انگلیسی …………………………………………………………………………………………………..90
باکتری اشریشیاکلی بطور معمول در دستگاه گوارش PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران و پرندگان وجود دارد.سویه های بیماریزا، در شرایط استرس محیطی و تضعیف سیستم ایمنی باعث ایجاد کلی‌باسیلوز[1] در طیور می‌شوند. سویه های بیماریزا همچنین باعث ایجاد بیماریهای گوارشی و عفونت دستگاه ادراری در انسان می شوند. سویه‌های بیماریزای اشریشیاکلی طیور[2] (APEC) بصورت عادی جزء میكروفلور طبیعی دستگاه گوارش طیور می‌باشند و ممكن است در سطوح مخاطی حیوانات اهلی و وحشی نیز یافت شوند. حدود 10 تا 15 درصد از کلی‌فرم[3]های روده، مربوط به سروتیپ‌های بیماریزا[4] می‌باشد. می‌توان سروتیپ‌های بیماریزا را همراه با سروتیپ‌های غیر بیماریزا[5] از محیط اطراف طیور جدا كرد. عفونت با سویه‌های APEC غالباً با عفونت‌های خارج گوارشی به ویژه عفونت‌های تنفسی و یا سیستمیك همراه است.
در بلدرچین سویه های اشریشیاکلی بیماریزا غالبا متعلق به گروه های سرمی O15,O4,O9,O38,O42,O88 و برخی سروگروه های دیگر می باشند. سروگروه های مذکور از موارد سپتی سمی کلی باسیلی، سلولیت و موارد مرگ جنینی جدا شده اند (10). بلدرچین به عنوان یک میزبان برای کلی باسیلوز شناخته می شود و پرورش دهندگان آن از این بابت خسارات زیادی را متحمل می شوند.
در کشور ما بعد از انقلاب، برای اولین بار پرورش بلدرچین[6] در استان یزد آغاز گردید که به صورت مجتمع شامل واحدهای مادر، گوشتی، بسته بندی و جوجه کشی اداره می‌گردد. وجود
ویژگیهای مناسب همچون رشد سریع، بلوغ زودرس، تولید تخم بالا، کوتاهی فاصله میان نسل‌ها، بالابودن تراکم پرورشی در واحد سطح، حساسیت کم نسبت به بعضی از بیماریهای طیور، قیمت بالای تولیدات که شامل گوشت و تخم می‌باشد و به خصوص بازگشت سریع سرمایه سبب شده است تا بلدرچین به عنوان یک پرنده مطلوب نزد کشاورزان و پرورش دهندگان تلقی شده و علاقمندان زیادی به پرورش صنعتی این پرنده روی آورند. بلدرچین دارای گوشتی با پروتئین بالا و درصد چربی کم می‌باشد که برای کودکان و بیماران بسیار سودمند و مفید می‌باشد.
پاتوتیپ تولید کننده شیگاتوکسین (STEC) اشریشیاکلی عامل بروز کولیت هموراژیک با منشا مواد غذائی در انسان است. امروزه سویه های STEC به عنوان گروهی از عوامل مسبب بیماریهای مشترک انسان و دام شناخته شده و خصوصا در کشورهای در حال توسعه بیماری های قابل توجهی در انسان ایجاد می کنند که شامل کولیت های هموراژیک و سندرم اورمی
می باشند. اخیرا مشخص شده که این سویه ها ممکن است در دامها و طیور سالم هم حضور داشته باشند. مهمترین عامل بیماریزایی این سویه ها، تولید شیگاتوکسین است که از مدفوع طیور و حیوانات سالم به محیط ،آب و غذا منتقل شده و باعث بیماری در انسان می گردد. سویه های STEC قادرند دو نوع شیگاتوکسین Stx1 و Stx2 را تولید نمایند. مطالعات اندکی در زمینه سویه های STEC جدا شده از طیور ، انجام شده است. از طرف دیگر آنالیز فیلوژنتیکی باکتری اشریشیاکلی نشان داده است که سویه های مختلف این باکتری در 4 گروه فیلوژنتیکی شامل A ,B1 B2 , وD قرار دارند.
از آنجائیکه تاکنون مطالعه فیلوژنتیکی بر روی سویه های اشریشیاکلی STEC جدا شده از بلدرچین وجود ندارد، لذا هدف از انجام این پایان نامه جدا سازی اشریشیاکلی از مدفوع
بلدرچین های سالم و شناسائی سویه های واجد ژن های کد کننده شیگا توکسین و انتیمین
(Stx1 و (eae, Stx2 و تعیین گروه فیلوژنتیکی اشریشیاکلی به روش PCR می باشد.
1-2 کلیاتی در مورد سویه های تولید کننده شیگاتوکسین [7]((STEC اشریشیاکلی
کشف پاتوتیپ اشریشیاکلی های تولید کننده شیگا توکسین (STEC) از زمانی آغاز شد که گروهی از دانشمندان گزارش کردند که مایع فیلتر شده ی کشت تعدادی از سویه های مختلف اشریشیاکلی برای سلولهای ورو[8] سایتوتوکسیک کشنده بوده و این فعالیت کشندگی سلول با آنتی سرم انتروتوکسین [9] اشریشیاکلی های شبه کلرای کلاسیک خنثی نمی شد. متعاقباً آنالیز 136 سویه اشریشیاکلی آشکار ساخت که 10 مورد از این سویه ها قادر به تولید این سیتوتوکسین سلول های ورو [10]هستند. بعد از اخذ این نتایج، اهمیت حضور سویه های اشریشیاکلی O26 تولید کننده سیتوتوکسین درارتباط با اسهال خونی مشخص شد در سال 1983 ارتباطی بین یک سروتیپ نادر از اشریشیاکلی (O157:H7) والتهاب کولون خونریزی دهنده [11] گزارش شد. در همان سال گروهی از محققین ارتباط بین حضور شیگاتوکسین تولید شده توسط اشریشیاکلی و بروز سندرم یورمی انسان را مطرح کردند. این مشاهدات باعث توجه قابل ملاحظه ای به پاتوتیپ STEC شد و از آن زمان تاکنون بیش از 200 تیپ مختلف اشریشیاکلی گزارش شده اند که شیگاتوکسین تولید می کنند و تعداد زیادی از آنها با بیماری های انسان ارتباط دارند(4)
1-1-2 وروتوكسین ها یا توكسین های شبیه شیگا
از نظر تاریخچه در سال 1977 كنوالجوك[12] ، كلمه وروتوكسین را برای سیتوتوكسین اشریشیاكلی بكار برد در یك مطالعه كه برروی 136 سویه اشریشیاكلی انجام گرفت، 7 مورد از 10 سویه ای كه وروتوكسین تولید می كردند با بیماری اسهال انسانی و یك مورد از آنها با اسهال خوكها ارتباط داشتند. در یك مطالعه مقدماتی در سال 1977 و مورد كامل آن در سال 1982، گزارش گردید كه سویه های خاصی از ETEC، سیتوتوكسینی را تولید می كنند كه برای سلولهای هلا[13] كشنده است همانند توكسین شیگا این سیتوتوكسین نیز از سنتز پروتئینی در سلول های هلا ممانعت می كند و از طرف دیگر در روده خرگوش اثرات آنتروتوكسیك داشته و برای موش نیز كشنده است، به همین دلیل این سیتوتوكسین را توكسین شبیه شیگا نام نهادند. در سال 1983 SLT خالص گردید و نشان دادند كه توكسین شیگا تولید شده بوسیله شیگلادیسانتریه و SLT تولید شده بوسیله اشریشیاكلی ازنظر خصوصیات فیزیكوشیمیایی و فعالیت های بیولوژی مشابهند (22).
در سال 1977 طی مطالعه ای مشخص گردید كه وروتوكسین تولید شده بوسیله یك سویه خوكی و یك سویه انسانی، بوسیله آنتی سرم خاص وروتوكسین سویه دیگر خنثی نمی شود و بدنبال آن، دو گروه آنتی ژنی وروتوكسین كشف گردید و آنها را VT2 , VT1 یا SLT-I و SLT-II نامیدند و متعاقب آن انواع SLT كه با SLT-II مرتبط بودند شناسایی گردید مطالعات بعدی نشان داد كه SLTها متعلق به دو گروه هستند که گروه اول از نظر پادگنی فقط یك نوع داشته و تحت عنوان VT-1 یا SLT-1 نامیده می شود و فعالیت آن بوسیله آنتی سرم توكسین شیگا خنثی می گردد و گروه دوم SLT، شامل سایر وروتوكسین هاست كه شامل گروهی است كه از نظر آنتی ژنی، با هم ارتباط نزدیكی دارند و فعالیت سیتوتوكسیك این گروه بوسیله آنتی سرم ضد SLT-I و آنتی بادیهای ضدتوكسین شیگا خنثی نمی شود. در اعضاء‌گروه دوم واریانتی از SLT-II كه آن را با SLT-II یا VTe نشان می دهند وجود دارد كه در بیماری ادمی خوك دخالت دارد. SLT-II به این دلیل واریانتی از SLT-II نامیده می شود كه، برخلاف SLT-II برروی سلول های هلا اثر نداشته یا تاثیر كمتری دارد (37). البته SLT-IIa نیز واریانت دیگری است كه از موارد اسهال نوزادان جدا شده است این توكسین بوسیله اشریشیاكلی O128 تولید می گردد (34 و 22).
2-1-2 ژنتیك وروتوكسین
در ابتدا مشخص گردید كه ژنهای وروتوكسین ها مربوط به باكتریوفاژهای معتدل[14] بوده و متعاقب آن ژنهای SLT-I این باكتریوفاژها كلون گردید و توالی نوكلئوتیدهای آن تعیین شد اپرن SLT-I، دوچارچوب خواندن[15] را شامل می شود كه یكی برای كد كردن تحت واحد A و دیگری برای تحت واحد كوچك B بكار می رود.
مقایسه توالی نوكلئوتیدی SLT-II نیز در اشریشیاكلی با SLT-I نشان می دهد كه در مشابهت توالی نوكلئوتیدها ژنهای ساختمانی برای دوتوكسین در تحت واحد A 57% و در تحت واحد B، 60% می باشد (34).
همچنان كه قبلا گفته شد در گروه دوم SLT چندین نوع SLT-II وجود دارد و ژنهای هر كدام از آنها نیز مطالعه شده و با سایر SLTها مقایسه گردیده است ولی برای جلوگیری از طولانی شدن مبحث از توضیح آنها خودداری می گردد.
3-1-2 ساختمان وروتوكسین ها
ساختمان تحت واحدهای SLT بخاطر مشابهت آن با توكسین شیگا براحتی مطالعه شده و ساختار آن كاملا مشخص شده است كه به كمك اطلاعات بدست آمده از توالی نوكلئوتیدها و همچنین خالص سازی توكسین این امر میسر گردیده است. SLTها از دو تحت واحد تشكیل شده اند كه تحت واحد A تقریبا 33 كیلودالتون و تحت واحدB حدود 5/7 كیلودالتون وزن دارد. تعداد تحت واحد B مشابه توكسین شیگا 5 تا بوده و در اتصالSLT به رسپتور گلیكولیپیدی نقش دارد.
از نظر فعالیت بیولوژی، تمامی وروتوكسین ها برای سلول های ورو (Vero) سمی بوده و برای موش كشنده اند همچنین برای خرگوش آنتروتوكسیك اند این توكسین مانع از سنتز پروتئین شده و كمتر از یك ساعت بعد از در معرض قرار گرفتن سلول، قابل تشخیص است. وروتوكسین ها برای سلول های اندوتلیال عروقی نیز سمی بوده و علائمی كه در بیماری بروز می كند مربوط به تاثیر توكسین برروی این بافت ها است.
موشی كه مورد تزریق این توكسین قرار گیرد قبل از مرگ، دچار فلجی اندام خلفی می شود كه این حالت احتمالا بعلت آسیب به سیستم اعصاب مركزی است كه بعدا منجر به مرگ حیوان می گردد. در خرگوش و خوك نیز كانون های گسترده هموراژی در عروق وادم مغزی دیده می شود كه در اثر SLT ایجاد شده و ضایعات مغزی منجر به مرگ حیوان می شود (20).
از نظر مكانیسم عمل،هر دو توكسین SLT-I و SLT-II در نتیجه فعالیت N-RNA گلیكوزیدازی مانع از سنتز پروتئین در سلول های اكاریوت می گردند. وروتوكسین ها باعث شكستن پیوند خاص N- گلیكوزیدی در RNA ریبوزمی s28 شده و در نتیجه آن یك باقیمانده آدنینی آزاد می شود و در نهایت سنتز پروتئینی صورت نمی گیرد.
از نظر اثرات بیماریزایی، سویه های تولید كننده این توكسین كه تحت عنوان VTEC [16] نامیده می شوند در انسان سه سندرم ایجاد می كنند كه عبارتند از اسهال، كولیت هموراژیك و سندرم اورمی همولیتیك(HUS)[17] (28)
اورمی همولیتیك با علائمی نظیر ناتوانی حاد كلیوی[18] ، ترمبوسیتوپنی[19] و آنمی همولیتیك[20] و اسهال توام است.
