تغییرات بیان ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae

 

 

 

 

 

تابستان 1393

 

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :

چکیده

تغییرات بیان ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae

به کوشش

سید حسین میرزابابایی

باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) بیمارگر مخربی است که دارای دامنه میزبانی بسیار وسیعی می­باشد به­طوریکه به بیش از 180 گونه گیاهی حمله می­ کند. مهمترین میزبان­های این بیمارگر درختان میوه هسته­دار، درختان میوه دانه­دار و گیاهان علفی می­باشد. به علت هم-تکاملی با بیمارگرها، گیاهان چندین مکانیسم دفاعی را برای حفاظت از خودشان ایجاد نموده اند. تجمع پروتئین های مرتبط با بیماریزایی مانند PR1, LOX2, PDF1.2و VSP2 یکی از مکانیسم های مقاومت گیاه به بیمارگر است. ایجاد گیاهان مقاوم، یکی از مهمترین استراتژی ها در مدیریت بیماری در محصولات زراعی و درختان میوه مختلف است. تشخیص مکانیسم های درگیر در پاسخ های گیاهان علیه بیمارگرها، می تواند تولید ارقام مقاوم را تسهیل کند و در این راستا، تشخیص ژن های درگیر در مقاومت گیاه میزبان می تواند گام سودمندی در توسعه ارقام مقاوم باشد. هدف از تحقیق حاضر بررسی الگوی تغییر بیان ژن PR1 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید و محدود کننده بیمارگرهای بیوتروف)، و ژن های LOX2, PDF1.2 و VSP2 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به جاسمونیک اسید محدود کننده بیمارگرهای نکروتروف و حشرات گیاهخوار)، در گیاه آرابیدوپسیس مایه زنی شده به Pss و در دو فاز مختلف رویشی و زایشی بود. نمونه های گیاه آرابیدوپسیس در زمان های 0، 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی جمع آوری شد و میزان جمعیت باکتری Pss در سطح گیاه نیز در این زمان­ها مورد بررسی قرار گرفت. سپس RNA کل استخراج شد و سنتز cDNA و تغییرات بیان چهار ژن با بهره گرفتن از روش Real time RT-PCR سنجیده شد. نتایج کلی نشان داد که گیاهان آرابیدوپسیس از مسیر دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید برای مقاومت به باکتری Pss استفاده نموده است و این که در فاز زایشی نسبت به فاز رویشی این مقاومت بیشتر می باشد. همچنین همکنش بین دو مسیر دفاعی وابسته به SA و JA نیز به اثبات رسید.

کلمات کلیدی: مقاومت سیستمیک اکتسابی، مقاومت سیستمیک القایی، بیان ژن، پروتئین های مرتبط با بیماریزایی

 

 

فهرست مطالب
عنوان                                                                                                           صفحه

فصل اول 1

1-1- مقدمه 2

1-2- اهداف 3

فصل دوم: پیشینه پژوهش 5

2-1- خصوصیات کلی Pss 6

2-1-1- موقعیت تاکسونومیکی 6

2-1-2- تولید فایتوتوکسین توسط Pss 7

2-1-3- دامنه میزبانی 7

2-1-4- بیماریزایی P. syringae 8

2-2- آرابیدوپسیس 9

2-3- واکنش Real-time RT-PCR 10

2-3-1- بیان ژن (Gen Expression) 11

2-4- دفاع در گیاهان 11

2-4-1- مقاومت ساختاری و القایی 12

2-4-2- مقاومت سیستمیک اکتسابی Systemic Aquired Resistance (SAR) 14

2-4-3- مقاومت سیستمیک القایی Induced Systemic Resistance (ISR) 17

2-4-4- پاسخ دفاعی 18

2-4-5- سیگنال های موجود در مقاومت به بیماری های گیاهی 18

2-4-6- تشخیص الیسیتورهای باکتریایی توسط سلول های گیاهی 21

2-4-7- همکنش گیاه- Pseudomonas syringae 24

2-4-8- تغییرات در سطح سلول 26

2-5- نقش دفاعی هورمون ها در گیاهان 27

2-5-1- هورمون سالیسیلیک اسید 29

2-5-2- هورمون جاسمونیک اسید 29

2-5-3- هورمون اتیلن 29

2-5-4- هورمون آبسیزیک اسید 30

2-5-5- هورمون اکسین 31

2-6- همکنش مسیر های هورمونی (Cross-talk) 32

2-6-1- اثر آنتاگونیستی SA بر سیگنالینگ JA 36

2-7- القاگرهای شیمیایی دفاعی در گیاهان 37

2-8- بررسی تعدادی از ژن های مرتبط با دفاع در گیاهان 38

2-8-1- ژن PDF1.2 38

2-8-2- ژن VSP2 38

2-8-3- ژن LOX2 39

2-8-4- ژن PR1 40

2-9- ملاحظات 40

فصل سوم: مواد و روش ها 42

3-1- تهیه باکتری Pss 43

3-1-1- خالص سازی باکتری 43

3-1-2- آزمون تولید لوان 43

3-1-3- آزمون تولید رنگ فلورسنت 44

3-1-4- آزمون اکسیداز 44

3-1-5- آزمون واکنش فوق حساسیت (HR) 44

3-1-6- اثبات بیماری زایی روی گیاه گوجه فرنگی 44

3-1-7- آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) 45

3-2- کاشت گیاه آرابیدوپسیس 47

3-2-1- محیط کشت آرابیدوپسیس 47

3-2-2- شرایط گلخانه 48

3-2-3- مایه زنی با Pss 49

3-2-4- نمونه برداری 49

3-3- بررسی میزان جمعیت باکتری Pss 50

3-4- استخراج DNA 51

3-4-1- طرز تهیه بافر CTAB 52

3-4-2- تهیه کلروفرم- ایزوآمیل الکل 52

3-5- استخراج RNA از بافت 52

3-5-1-تهیه آب تیمار شده با DEPC 53

3-5-2- تعیین کمیت و كیفیتRNA 54

3-5-3- تیمار DNase 54

3-5-4- توقف تیمار DNase 54

3-5-5- سنتز رشته اول cDNA با بهره گرفتن از RNA استخراج شده 55

3-5-6- تکثیر قطعه مورد نظر با بهره گرفتن از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز 56

3-5-7- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها 57

3-6- واكنش Real-time RT-PCR (Relative) 57

3-6-1- واكنش Real-time RT-PCRژن های مقاومت و ژن كنترل داخلی 58

3-6-2- روش نرمال سازی نسبی بیان ژن ها 59

3-6-3-آنالیز آماری بیان ژن ها 59

فصل چهارم: نتایج 60

4-1- آزمون های تشخیصی اولیه 61

4-1-1- استفاده از PCR جهت تشخیص Pss 62

4-2- بررسی جمعیت باکتری پس از مایه زنی 62

4-3- استخراج Total RNA از بافت گیاه 64

4-3-1- تعیین کیفیت Total RNA 64

4-3-2- تعیین غلظت Total RNA با بهره گرفتن از نانودراپ 64

4-3-3- تیمار DNase 65

4-3-4- بررسی صحت سنتز cDNA 66

4-5- بررسی بیان ژن ها 66

4-5-1- ژن PR1 67

4-5-2- ژن VSP2 68

4-5-3- ژن PDF1.2 70

4-5-4- ژن LOX2 71

4-5-5- الگوی بیان ژن ها در دو فاز مختلف رویشی و زایشی گیاهان آرابیدوپسیس 73

فصل پنجم: بحث 75

5-1- بحث 76

5-2- بررسی دفاع ذاتی وابسته به هورمون های سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید 77

5-3- آنالیز مقایسه ای تغییرات بیان ژن ها 79

3-۵-1- بررسی پاسخ ژن PR1 علیه Pss 79

3-۵-2- بررسی پاسخ ژن PDF1.2 علیه Pss 81

5-3-3- بررسی پاسخ ژن LOX2 علیه Pss 82

3-۵-4- بررسی پاسخ ژنVSP2 علیه Pss 83

5-4- تعیین جمعیت باکتری 84

5-5- نتیجه گیری نهایی 85

5-5-1- دو فرضیه احتمالی برای بیان مسیر وابسته به JA بلافاصله بعد از مسیر وابسته به SA 86

پیشنهادات 90

منابع 91

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها
عنوان                               صفحه

شکل 3-1- کاشت گیاهان آرابیدوپسیس در سیستم هیدروپونیک 49

شکل 4-1- انجام واکنش HR در گیاه توتون و شمعدانی وآزمایش بیماریزایی در گیاه گوجه فرنگی 61

شکل 4-2- الکتروفورز محصول PCRتشخیصی با بهره گرفتن از جفت آغازگرهای B2 و B1 62

شکل 4-3- بررسی جمعیت باکتری در زمان های نمونه برداری پس از مایه زنی در دو فاز مختلف

 

رویشی و زایشی 63

شکل 4-4- الکتروفورز Total RNA استخراج شده از بافت ها 64

شکل 4-5- طیف جذب نوری Total RNA استخراج شده با بهره گرفتن از نانودراپ 65

شکل 4-6- الکتروفورز محصول PCR بعد از تیمار DNase 65

شکل 4-7- الکتروفورز محصول PCR پس از سنتز cDNA 66

شکل 4-8-تغییرات بیان ژن PR1 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 68

شکل 4-9- تغییرات بیان ژن VSP2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 69

شکل 4-10-تغییرات بیان ژن PDF1.2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 71

شکل 4-11-تغییرات بیان ژن LOX2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 72

شکل 4-12- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز رویشی گیاهان 74

شکل 4-13- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز زایشی گیاهان 74

فهرست جداول
عنوان                                           صفحه

جدول 3-1- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام واکنش 25 میکرولیتری PCR جهت تشخیص Pss 45

جدول 3-2- سیکل دمایی PCR با آغازگرهای B1-B2 برای تشخیص Pss 46

جدول3-3- نوع و مقدار عناصر غذایی محیط کشت هوگلند 48

جدول 3-4- مقادیر و نوع مواد مورد نیاز برای تهیه 100 میلی لیتر بافر CTAB 52

جدول 3-5- نوع و مقدار مواد مورد نیاز برای تیمار DNase 54

جدول 3-6- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله اول 55

جدول 3-7- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله دوم 55

جدول 3-8- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام یک واکنش 20 میکرولیتری PCR 56

جدول 3- 9- سیکل دمایی PCR با آغازگر ef1-α 56

جدول 3-10- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها 57

جدول 3-11- سیكل دمایی مورد استفاده در واكنش Real-time RT-PCR 58

جدول3-12- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واكنش 20 میکرولیتری Real-time RT-PCR برای ژن های اصلی و كنترلی داخلی 58

جدول 4-1- مقایسه میانگین جمعیت باکتری Pss در دو فاز مختلف زایشی و رویشی 63

جدول 4-2- مقایسه میانگین بیان ژن PR1 67

جدول 4-3- مقایسه میانگین بیان ژن VSP2 68

جدول 4-4- مقایسه میانگین بیان ژن PDF1.2 70

جدول 4-5- مقایسه میانگین بیان ژن LOX2 71

 

 
 
 
 
فصل اول

 

1-1- مقدمه
یکی از مهمترین عوامل بیماریزا در گیاهان باکتری های وابسته به جنس Pseudomonas هستند. این گروه از باکتری ها جزو مهمترین بیمارگرهای گیاهی بوده که نقش عمده ای در پایین آوردن کمیت و کیفیت محصولات کشاورزی داشته و دارای گسترش جهانی نیز می باشند، و بیماری هایی از قبیل لکه برگی، بلایت، پژمردگی آوندی، پوسیدگی نرم، شانکر و گال در گیاهان مختلف ایجاد می کنند.

یکی از بیماری های مهمی که توسط باکتری های این گروه ایجاد می شود شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار می باشد که توسط Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) ایجاد می شود و یکی از معضلات کشاورزان در سراسر جهان به شمار می رود .(Vicente et al., 2004) این بیماری خسارت زیادی وارد می سازد و سبب خشک شدن نهال ها و درختان جوان، کاهش محصول در درختان مسن و گاهی خشکیدگی جوانه ها و گل های درختان بیمار می شود و معمولاً در باغ های جوان موجب نابودی درختان به میزان 10 تا 75 درصد می شود (Agrios, 2005). باکتری عامل بیماری شانکر اولین بار از یاس جداسازی و در سال 1902 به این نام نامگذاری شد (Hirano and Upper, 2000). در ایران اولین بار بیماری شانکر باکتریایی از درختان زردآلو در اصفهان گزارش و میزان خسارت ناشی از آن 22 تا 50 درصد ذکر گردید (بهار و همکاران، 1361).

باکتری Pss علاوه بر بیماری شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار، عامل بیماری های مهمی همچون لکه قهوه ای لوبیا، بلاست مرکبات، لکه باکتریایی سورگوم و نوار قرمز نیشکر می باشد (Gross and Devay, 1977; Hirano, 1995; Rahimian, 1995). این باکتری بعنوان بیمارگر از گندم، ذرت، ارزن، سیب، گلابی، چغندر قند، کیوی و شمار دیگری از گیاهان زراعی و علف های هرز نیز جداسازی شده است(Balestra and Varvaro, 1997; Garden et al., 1991; Lindow, 1982).

در ایران باکتری مذکور تاکنون از گیاهان مختلفی مانند نیشکر (Rahimian, 1995)، درختان میوه هسته دار (بهار و همکاران، 1361؛ مزارعی و قاسمی، 1372) و گندم (افیونیان و صحراگرد، 1375) جداسازی شده است. این باکتری همچنین روی گیاه گوجه فرنگی نیز ایجاد بیماری می کند، اگرچه این بیماری به ندرت عملکرد را کاهش می دهد ولی باعث کاهش کیفیت می شود (Gleason and Edmunds, 2006).

جمعیت این باکتری با مراحل رشدی گیاه ارتباط دارد. به طوریکه در زمان متورم شدن جوانه ها و ظهور شکوفه ها که میزان تراوه های گیاه زیاد است، جمعیت این باکتری نیز بسیار بالاست. در این موقع میزان ترشحات و مواد قندی گیاه فراوان است و باکتری از آنها برای تغذیه خود استفاده نموده و جمعیت خود را افزایش می دهد.

به نظر می رسد سویه هایPss در میزبان های مختلف، دارای نوعی ویژگی تخصص میزبانی نیز هستند. به طور مثال سویه های Pss جدا شده از لوبیا باعث ایجاد واکنش بیماریزایی روی لوبیا می شوند در حالیکه سویه های این باکتری که از سایر میزبان ها جدا شده اند، تولید واکنش های غیر بیماریزایی در لوبیا می نمایند (Little et al., 1998).

نام این باکتری اغلب با سه اصطلاح اپی فیت، بیمارگر و هسته یخ همراه بوده است که نشان دهنده اهمیت حضور Pss روی گیاهان میزبان است (Hirano et al., 1995).

1-2- اهداف
به دلیل اهمیت این باکتری از نظر ویژگی های گستردگی دامنه میزبانی، اپی فیتی، ایجاد هسته یخ و بیماریزایی تحقیقات زیادی روی Pss صورت گرفته است. به طور مثال سیستم های بیماریزایی این باکتری مانند سیستم ترشحی پروتئینی نوع سه، زهرابه های دخیل در بیماریزایی آن مانند سیرینگومایسین و سیرینگوپپتین، ژن های مرتبط با بیماریزایی مانند syr B, syrD, hrp، افکتورهای پرآزاری و ناپرآزاری و … مورد بررسی قرار گرفته اند. با وجود این تحقیقات گسترده و همچنین روش های مدیریتی گوناگون برای کنترل بیماری های ایجاد شده توسط Pss، متاسفانه هنوز روش موثر و کارآمدی وجود ندارد. بنابراین تحقیقات بیشتر جهت دستیابی به روش های موثر و جدید برای کنترل بیماری های ایجاد شده توسط Pss مورد نیاز است. یکی از این زمینه های تحقیقاتی درک مکانیسم مقاومت گیاه به بیمارگر می باشد. از این رو هدف غایی این پژوهش بررسی همکنش بین آرابیدوپسیس- Pss و باز خوانی مسیرهای دفاعی گیاه آرابیدوپسیس به بیمارگر Pss می باشد. اهداف مد نظر این پژوهش در زیر آورده شده است:

بررسی تغییرات بیان چهار ژن PR1, PDF1.2, LOX2 و VSP2 مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس آلوده به Pss
بررسی همکنش دو مسیر دفاعی وابسته به سالسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در گیاهان آرابیدوپسیس آلوده به Pss
مقایسه پاسخ های دفاعی گیاهان آرابیدوپسیس آلوده به Pss در دو فاز مختلف رویشی و زایشی
بررسی میزان جمعیت باکتریPss در دو فاز رویشی و زایشی گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی
 

 
ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل و با فرمت ورد موجود است

متن کامل را می توانید دانلود نمائید

چون فقط تکه هایی از متن پایان نامه در این صفحه درج شده (به طور نمونه)

ولی در فایل دانلودی متن کامل پایان نامه

 با فرمت ورد word که قابل ویرایش و کپی کردن می باشند

موجود است