مهر 1388
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده
 
مقدمه 

علایم اختصاری
 
فصل اول: بررسی منابع
 
1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی
1
2-1- کلون­کردن ژن
3
                         1-2-1- ابزار و عوامل کلون­کردن ژن
4
                                    1-1-2-1- آنزیم­های برشی
4
                                   2-1-2-1- آنزیم DNA لیگاز
5
                         2-2-1- وکتورهای کلونینگ
6
                                     1-2-2-1- پلاسمیدها
10
3-1- سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین­های نو­ترکیب
11
                       1-3-1- باکتری E. coli بعنوان میزبان بیان کننده پروتئین­های نو­ترکیب
15
                       2-3-1- وکتور بیان­کننده
15
                                    1-2-3-1- پروموتر
16
                                               1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET
17
                                    2-2-3-1- منشاء همانند­سازی
18
                                   3-2-3-1- مارکر انتخابی
18
                                    4-2-3-1- خاتمه دهنده رونویسی
19
                                    5-2-3-1- سیگنالهای ترجمه یکی از عوامل مؤثر در افزایش بیان
19
                                   6-2-3-1- انتخاب کدون
20
4-1- مسائلی در مورد تولید پروتئین­های نو­ترکیب در اشرشیاکلی
21
                        1-4-1- پایداری پلاسمید
21
                       2-4-1- عدم حذف متیونین در انتهای N ترمینال پروتئین نو­ترکیب
22
                        3-4-1- بار متابولیکی
23
                        4-4-1- مشکلات بیان پروتئین­های نوترکیب در سیتوپلاسم باکتری اشرشیاکلی.
23
5-1- سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی
25
6-1- سایتوکاین­ها
25
                        1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)
26
                                     1-1-6-1- ویژگی­های ژن و مولکول TNFα
27
                                     2-1-6-1- ویژگی های ساختاری پروتئین TNF
28
                                     3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفامیلی آنها
29
                                     4-1-6-1- نقش بیولوژیکی TNFα
31
                                     5-1-6-1- مکانیسم عمل
31
7-1- TNF-α و نقش آن در برخی از بیماری­های تحلیل عصبی
34
                       1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD)
34
                       2-7-1- TNF و ایسکمی مغزی
35
                       3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون
36
 دستگاه­های مورد استفاده
 
فصل دوم : مواد و روش­ها
 
1-2- نمونه­گیری از خون انسان
38
2-2- استخراج ­RNAی کل از خون
38
             1-2-2- وسایل لازم
38
            2-2-2- روش کار
39
3-2- سنتز cDNA
40
                        1-3-2- روش کار
41
4-2- کلونینگ cDNA­ ی کد کننده TNF-α­ی انسان
41
                        1-4-2- طراحی جفت پرایمرها
41
                        2-4-2- واکنش PCR
42
                                     1-2-4-2- الکتروفورز با ژل آگاروز
43
                                        1-1-2-4-2- مواد و وسایل مورد نیاز
43
                                       2-1-2-4-2- روش کار
43
                                      3-1-2-4-2- رنگ­آمیزی ژل آگارز با اتیدیوم بروماید
43
                        3-4-2- خالص­سازی محصول PCR با استفاده از کیت
44
                       4-4-2- کلونینگ cDNA کد کننده TNF-α در وکتور pBR322
45
                                     1-4-4-2- انجام واکنش اتصال
47
                                     2-4-4-2- ترانسفورماسیون محصول اتصال به باکتری
47
                                     3-4-4-2- میزبان باکتریایی E. coli
47
                                     4-4-4-2- کشت و نگهداری باکتری­ها
48
                                      5-4-4-2- تهیه باکتریهای مستعد (Competent bacteria) 

برای پذیرش DNA  پلاسمیدی خارجی
  

49
                              6-4-4-2- انتقال پلاسمید به درون سلول­های مستعد باکتریایی
50
                                7-4-4-2- غربال کردن کلون‌های واجد پلاسمید نو­ترکیب و کشت کلونی باکتریایی.
50
                              8-4-4-2- استخراج DNA پلاسمیدی نو­ترکیب
51
                              9-4-4-2- تایید کلنی­های حاوی اینسرت توسط PCR و آنزیم­های برشی
51
                       5-4-2- کلونینگ cDN­ی کد­کننده TNF-α در حامل pET21
52
                                     1-5-4-2- برش حامل pET21
52
                                    2-5-4-2- اتصال ­cDNAی TNF-α به حامل pET21
54
                     6-4-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتریE.coli  سویه BL21(DH3) برای بررسی
پروتئین نوترکیب
54
                                   1-6-4-2- انتخاب کلون­های ترانسفورم شده و کشت کلنی­ها
54
5-2- روش­های مربوط به بررسی بیان پروتئین hTNFα نو­ترکیب
55
                        1-5-2- القاء بیان پروتئین نو­ترکیب
55
                        2-5-2- تهیه نمونه پروتئینی جهت SDS-PAGE
55
                                    1-2-5-2- SDS-PAGE
56
                                    2-2-5-2- مواد لازم جهت SDS-PAGE
57
                                    3-2-5-2- روش آزمایش
57
                       3-5-2- وسترن بلاتینگ
59
6-2- نرم­افزارها
61
فصل سوم : نتایج
 
1-3- نمونه­های خون
62
2-3- استخراج RNA کل از خون
62
3-3- سنتز cDNA کل
63
                     1-3-3- تکثیر توالی کد­کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی
63
4-3- کلون­سازی توالی کد کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی تکثیر شده با روش PCR در پلاسمید pBR322 و ساخت پلاسمید نو­ترکیب pBRtnf
  

 

64
5-3- ساخت پلاسمید بیان کننده نو­ترکیب pET21tnf
67
6-3- بررسی بیان پروتئین نو­ترکیب در E. coli
71
7-3- مقایسه اثر غلظت­های مختلف IPTG در میزان بیان پروتئین
72
8-3- بررسی میزان بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء
73
9-3- وسترن بلاتینگ
74
فصل چهارم : بحث
 
4-1- بحث
75
فصل پنجم : نتیجه­گیری و پیشنهادات
 
نتیجه­گیری و پیشنهادات
80
منابع مورد استفاده
81
فهرست جداول 

عنوان
جدول 1-1 : برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی………………………..3
جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین­های نوترکیب…….12
جدول 3-1 : تعدادی از پروموترهای مورد استفاده برای بیان ژن در E. coli…………..17
جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز cDNA…………………………………………………40
جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادیر بر حسب میکرولیتر)……………………………..42
جدول 3-2 : واکنش برش آنزیمی………………………………………………………………………46
جدول 4-2 :  ترکیبات واکنش اتصال  TNF-αو pBR322………………………………..47
جدول 5-2 : فهرست سویه‌های E. coli استفاده شده در این تحقیق……………………..47
جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB……………………………………………………………..48
جدول 7-2 : مخلوط واکنش برای برش آنزیمی……………………………………………………54
جدول 8-2 : اجزای واکنش اتصال……………………………………………………………………..54
جدول 9-2 : تهیه 12 میلی­لیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد………………………57
جدول 10-2 : تهیه 5 میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد………………………….57
جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x)……………………………………………………………..57
جدول 12-2 : ترکیبات بافر الکترود (بافر مخازن)…………………………………………………57
 

فهرست اشکال
شکل 1-1 : اجزاء اولیه و اصلی وکتور بیان­کننده ژن در E. coli………………………………..16
شکل 2-1: نقشه کروموزوم MHC انسان و ژن hTNFα…………………………………………27
شکل 3-1 : ساختار کریستالی TNFα بر گرفته از Protein Data Bank………………..29
شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1………………………………………………………33
شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pBR322 (اقتباس از فرمنتاس)…………………………..46
شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)………………………53
شکل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم………………………………………………………………..62
شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خون با استفاده از کیت……63
شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نو­ترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز………………………………..64
شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ………………………………………………….65
شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نو­ترکیب pBRtnf در مقایسه با pBR322 فاقد cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا……………………………………………………………66
شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نو­ترکیب بر روی ژل آگارز………67
شکل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب pET21tnf…………………………………………………….68
شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول  PCRپلاسمید نو­ترکیب pETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………69
شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب pET21tnf برش یافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI– HindIIIبر روی ژل آگارز…………..70
شکل 10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینه­ای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نو­ترکیب به دست آمده، pET21tnf………………………………………………………71
شکل 11-3 : بیان ژن TNF-α انسانی در BL21 E. coli………………………………………72
شکل 12-3 : مقایسه غلظت­های مختلف IPTG بر روی بیان……………………………………73
شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء…………………………….73
شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظت­های 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلی­مولار..74
علایم اختصاری:

LB: Luria Bertani

NK cell: Natural killer cell

OD: Optical Density

TNF: Tumor Necrosis Factors

TAE: Tris-acetate EDTA

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction

rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha

MCS: Multiple cloning site

LPS: Lipopolysaccharide

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

 

IL: Interleukin

INF: Interferon

EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid

DW: Distilled water

APS: Ammonium persulfate

MS: Multiple Sclerosis

TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine or N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,2-diaminoethan

TE: Tris EDTA

TM: Melting temperature 

RCLB: Red Cell Lysis Buffer

CTL : Cytotoxic T cell

X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside

MHC: Major Histocompatibility Complex

AD: Alzheimer’s disease

PD: Parkinson’s disease

LT: Lymphotoxin

TLR: Toll-like receptor

FADD: Fas-Associated protein with Death Domain

RIP: Receptor Interacting Protein

 

 

 

 

 

چکیده

سایتوکاین ها خانواده ای از فاکتورهای رشد هستند که توسط سلول های سیستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد می باشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان یک مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهای تحریک شده با باکتری ترشح می شود. علیرغم ابنکه مقادیر محدودی TNF-α از منابع طبیعی آن بدست می آید اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را می توان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراین ترجیح داده می شود برای تولید این پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده میکروبی و نیز گیاهان استفاده گردد.

در اینجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ی mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سایت برشی EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بیان، ژن هدف در پلاسمید  تحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژ T7 کلون گردید به این ترتیب که وکتور نوترکیب و نیز هر دو با آنزیم های NdeI-HindIII بریده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطی شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسی صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coli از طریق تکنیک های  SDS-PAGEو نیز وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت.

 

 


مقدمه

فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکاینی پیش التهابی است که در راه اندازی و تنظیم سیستم ایمنی ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب های بیماری زا از طریق فراخوانی نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α برای اولین بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس یا آندوتوکسین باکتری ها تیمار شده بودند جداسازی شد که در مرگ سلول های توموری نقش ایفاء می کرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما این پلی پپتید 17 کیلودالتونی دارای عملکردهای متعددی نظیر دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظیم خواب و رشد رویان می باشد.این فاکتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT  ی CD4+، لنفوسیت هایT  ی CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بیان می شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.

TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نیز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروکاریوتی در کشور می تواند باعث فراهم شدن زمینه جهت انجام تحقیقات بعدی نظیر تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نیز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.

1-1-     بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی

موضوعات: بدون موضوع
[یکشنبه 1398-07-14] [ 07:52:00 ق.ظ ]