مهر 1388
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
چکیده
مقدمه
علایم اختصاری
فصل اول: بررسی منابع
1-1- بیوتکنولوژی پروتئینهای دارویی
1
2-1- کلونکردن ژن
3
1-2-1- ابزار و عوامل کلونکردن ژن
4
1-1-2-1- آنزیمهای برشی
4
2-1-2-1- آنزیم DNA لیگاز
5
2-2-1- وکتورهای کلونینگ
6
1-2-2-1- پلاسمیدها
10
3-1- سیستمهای بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئینهای نوترکیب
11
1-3-1- باکتری E. coli بعنوان میزبان بیان کننده پروتئینهای نوترکیب
15
2-3-1- وکتور بیانکننده
15
1-2-3-1- پروموتر
16
1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET
17
2-2-3-1- منشاء همانندسازی
18
3-2-3-1- مارکر انتخابی
18
4-2-3-1- خاتمه دهنده رونویسی
19
5-2-3-1- سیگنالهای ترجمه یکی از عوامل مؤثر در افزایش بیان
19
6-2-3-1- انتخاب کدون
20
4-1- مسائلی در مورد تولید پروتئینهای نوترکیب در اشرشیاکلی
21
1-4-1- پایداری پلاسمید
21
2-4-1- عدم حذف متیونین در انتهای N ترمینال پروتئین نوترکیب
22
3-4-1- بار متابولیکی
23
4-4-1- مشکلات بیان پروتئینهای نوترکیب در سیتوپلاسم باکتری اشرشیاکلی.
23
5-1- سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی
25
6-1- سایتوکاینها
25
1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)
26
1-1-6-1- ویژگیهای ژن و مولکول TNFα
27
2-1-6-1- ویژگی های ساختاری پروتئین TNF
28
3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفامیلی آنها
29
4-1-6-1- نقش بیولوژیکی TNFα
31
5-1-6-1- مکانیسم عمل
31
7-1- TNF-α و نقش آن در برخی از بیماریهای تحلیل عصبی
34
1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD)
34
2-7-1- TNF و ایسکمی مغزی
35
3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون
36
دستگاههای مورد استفاده
فصل دوم : مواد و روشها
1-2- نمونهگیری از خون انسان
38
2-2- استخراج RNAی کل از خون
38
1-2-2- وسایل لازم
38
2-2-2- روش کار
39
3-2- سنتز cDNA
40
1-3-2- روش کار
41
4-2- کلونینگ cDNA ی کد کننده TNF-αی انسان
41
1-4-2- طراحی جفت پرایمرها
41
2-4-2- واکنش PCR
42
1-2-4-2- الکتروفورز با ژل آگاروز
43
1-1-2-4-2- مواد و وسایل مورد نیاز
43
2-1-2-4-2- روش کار
43
3-1-2-4-2- رنگآمیزی ژل آگارز با اتیدیوم بروماید
43
3-4-2- خالصسازی محصول PCR با استفاده از کیت
44
4-4-2- کلونینگ cDNA کد کننده TNF-α در وکتور pBR322
45
1-4-4-2- انجام واکنش اتصال
47
2-4-4-2- ترانسفورماسیون محصول اتصال به باکتری
47
3-4-4-2- میزبان باکتریایی E. coli
47
4-4-4-2- کشت و نگهداری باکتریها
48
5-4-4-2- تهیه باکتریهای مستعد (Competent bacteria)
برای پذیرش DNA پلاسمیدی خارجی
49
6-4-4-2- انتقال پلاسمید به درون سلولهای مستعد باکتریایی
50
7-4-4-2- غربال کردن کلونهای واجد پلاسمید نوترکیب و کشت کلونی باکتریایی.
50
8-4-4-2- استخراج DNA پلاسمیدی نوترکیب
51
9-4-4-2- تایید کلنیهای حاوی اینسرت توسط PCR و آنزیمهای برشی
51
5-4-2- کلونینگ cDNی کدکننده TNF-α در حامل pET21
52
1-5-4-2- برش حامل pET21
52
2-5-4-2- اتصال cDNAی TNF-α به حامل pET21
54
6-4-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتریE.coli سویه BL21(DH3) برای بررسی
پروتئین نوترکیب
54
1-6-4-2- انتخاب کلونهای ترانسفورم شده و کشت کلنیها
54
5-2- روشهای مربوط به بررسی بیان پروتئین hTNFα نوترکیب
55
1-5-2- القاء بیان پروتئین نوترکیب
55
2-5-2- تهیه نمونه پروتئینی جهت SDS-PAGE
55
1-2-5-2- SDS-PAGE
56
2-2-5-2- مواد لازم جهت SDS-PAGE
57
3-2-5-2- روش آزمایش
57
3-5-2- وسترن بلاتینگ
59
6-2- نرمافزارها
61
فصل سوم : نتایج
1-3- نمونههای خون
62
2-3- استخراج RNA کل از خون
62
3-3- سنتز cDNA کل
63
1-3-3- تکثیر توالی کدکننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی
63
4-3- کلونسازی توالی کد کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی تکثیر شده با روش PCR در پلاسمید pBR322 و ساخت پلاسمید نوترکیب pBRtnf
64
5-3- ساخت پلاسمید بیان کننده نوترکیب pET21tnf
67
6-3- بررسی بیان پروتئین نوترکیب در E. coli
71
7-3- مقایسه اثر غلظتهای مختلف IPTG در میزان بیان پروتئین
72
8-3- بررسی میزان بیان پروتئین در زمانهای مختلف بعد از القاء
73
9-3- وسترن بلاتینگ
74
فصل چهارم : بحث
4-1- بحث
75
فصل پنجم : نتیجهگیری و پیشنهادات
نتیجهگیری و پیشنهادات
80
منابع مورد استفاده
81
فهرست جداول
عنوان
جدول 1-1 : برخی از پروتئینهای نوترکیب موجود در بازار دارویی………………………..3
جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستمهای بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئینهای نوترکیب…….12
جدول 3-1 : تعدادی از پروموترهای مورد استفاده برای بیان ژن در E. coli…………..17
جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز cDNA…………………………………………………40
جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادیر بر حسب میکرولیتر)……………………………..42
جدول 3-2 : واکنش برش آنزیمی………………………………………………………………………46
جدول 4-2 : ترکیبات واکنش اتصال TNF-αو pBR322………………………………..47
جدول 5-2 : فهرست سویه‌های E. coli استفاده شده در این تحقیق……………………..47
جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB……………………………………………………………..48
جدول 7-2 : مخلوط واکنش برای برش آنزیمی……………………………………………………54
جدول 8-2 : اجزای واکنش اتصال……………………………………………………………………..54
جدول 9-2 : تهیه 12 میلیلیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد………………………57
جدول 10-2 : تهیه 5 میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد………………………….57
جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x)……………………………………………………………..57
جدول 12-2 : ترکیبات بافر الکترود (بافر مخازن)…………………………………………………57
فهرست اشکال
شکل 1-1 : اجزاء اولیه و اصلی وکتور بیانکننده ژن در E. coli………………………………..16
شکل 2-1: نقشه کروموزوم MHC انسان و ژن hTNFα…………………………………………27
شکل 3-1 : ساختار کریستالی TNFα بر گرفته از Protein Data Bank………………..29
شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1………………………………………………………33
شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pBR322 (اقتباس از فرمنتاس)…………………………..46
شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)………………………53
شکل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم………………………………………………………………..62
شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خون با استفاده از کیت……63
شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نوترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز………………………………..64
شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ………………………………………………….65
شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نوترکیب pBRtnf در مقایسه با pBR322 فاقد cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا……………………………………………………………66
شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نوترکیب بر روی ژل آگارز………67
شکل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب pET21tnf…………………………………………………….68
شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول PCRپلاسمید نوترکیب pETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………69
شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب pET21tnf برش یافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI– HindIIIبر روی ژل آگارز…………..70
شکل 10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینهای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نوترکیب به دست آمده، pET21tnf………………………………………………………71
شکل 11-3 : بیان ژن TNF-α انسانی در BL21 E. coli………………………………………72
شکل 12-3 : مقایسه غلظتهای مختلف IPTG بر روی بیان……………………………………73
شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمانهای مختلف بعد از القاء…………………………….73
شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظتهای 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلیمولار..74
علایم اختصاری:
LB: Luria Bertani
NK cell: Natural killer cell
OD: Optical Density
TNF: Tumor Necrosis Factors
TAE: Tris-acetate EDTA
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis
RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction
rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha
MCS: Multiple cloning site
LPS: Lipopolysaccharide
IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
IL: Interleukin
INF: Interferon
EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid
DW: Distilled water
APS: Ammonium persulfate
MS: Multiple Sclerosis
TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine or N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,2-diaminoethan
TE: Tris EDTA
TM: Melting temperature
RCLB: Red Cell Lysis Buffer
CTL : Cytotoxic T cell
X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside
MHC: Major Histocompatibility Complex
AD: Alzheimer’s disease
PD: Parkinson’s disease
LT: Lymphotoxin
TLR: Toll-like receptor
FADD: Fas-Associated protein with Death Domain
RIP: Receptor Interacting Protein
چکیده
سایتوکاین ها خانواده ای از فاکتورهای رشد هستند که توسط سلول های سیستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد می باشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان یک مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهای تحریک شده با باکتری ترشح می شود. علیرغم ابنکه مقادیر محدودی TNF-α از منابع طبیعی آن بدست می آید اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را می توان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراین ترجیح داده می شود برای تولید این پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده میکروبی و نیز گیاهان استفاده گردد.
در اینجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ی mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سایت برشی EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بیان، ژن هدف در پلاسمید تحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژ T7 کلون گردید به این ترتیب که وکتور نوترکیب و نیز هر دو با آنزیم های NdeI-HindIII بریده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطی شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسی صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coli از طریق تکنیک های SDS-PAGEو نیز وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت.
مقدمه
فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکاینی پیش التهابی است که در راه اندازی و تنظیم سیستم ایمنی ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب های بیماری زا از طریق فراخوانی نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α برای اولین بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس یا آندوتوکسین باکتری ها تیمار شده بودند جداسازی شد که در مرگ سلول های توموری نقش ایفاء می کرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما این پلی پپتید 17 کیلودالتونی دارای عملکردهای متعددی نظیر دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظیم خواب و رشد رویان می باشد.این فاکتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT ی CD4+، لنفوسیت هایT ی CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بیان می شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.
TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نیز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروکاریوتی در کشور می تواند باعث فراهم شدن زمینه جهت انجام تحقیقات بعدی نظیر تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نیز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.
1-1- بیوتکنولوژی پروتئینهای دارویی
