استاد راهنما:
دکتر خشنود نوراللهی
استاد مشاور:
مهندس حسن یونسی
شهریور 93
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده

نخود مهم­ترین گیاه از خانواده حبوبات در حوزه مدیترانه، شبه قاره هند، غرب آسیا و شمال آفریقا است. بیماری پژمردگی نخود با عامل Fusarium oxysporum f. sp. ciceri یکی از مهم­ترین بیماری­های این گیاه در جهان به­شمار می­رود. این بیماری در تمام مناطق نخودکاری ایران گزارش شده است. بیماری همه ساله در تمام مناطق نخودکاری استان ایلام باعث خسارت فراوانی می­شود بطوری­که در برخی از مزارع به 50 % تا 70 % هم میرسد. این تحقیق به منظور بررسی و تعیین تنوع ژنتیکی قارچ عامل بیماری زردی و پژمردگی نخود انجام گرفت. برای این منظور از مناطق نخودکاری استان شامل شش شهرستان از جمله آسمان­آباد، ایوان، بدره، چرداول، دره­شهر، سرابله نمونه­برداری صورت گرفت. پس از جداسازی، خالص­سازی و شناسایی قارچ عامل بیماری و معرفی F. oxysporum f. sp. ciceri به عنوان عامل غالب بیماری، بررسی تنوع ژنتیکی جدایه­ها با استفاده از پنج جفت نشانگر ریزماهواره صورت گرفت، نهایتاً در مجموع 17 آلل در بین جمعیت­ها مشاهده شد نتایج تجزیه واریانس مولکولی حاکی از تنوع بالای درون جمعیتی معادل 92 درصد و تنوع پایین بین جمعیت­های مناطق مختلف در حدود 8 درصد داشت. جریان ژنی (Nm) بالا و برابر 589/7 به­دست آمد. بنابراین تمایز ژنتیکی (Gst) به میزان کمی 0618/0 مشاهده گردید. دندروگرام رسم شده بر اساس فاصله ژنتیکی بین جمعیت­های مورد مطالعه در این تحقیق، نشان داد که جمعیت­های آسمان­آباد و سرابله در دو گروه جدا قرار گرفته­اند و نسبت به جمعیت-های دیگر تفاوت ژنتیکی بیشتری دارند. نتایج حاصل از این تحقیق در جهت کمک به متخصصین اصلاح نباتات و بیماری­شناسان گیاهی در جهت اصلاح ارقام نخود می­باشد.

کلیدواژه: نخود، Fusarium oxysporum f. sp. ciceri، تنوع ژنتیکی، ریزماهواره

فهرست مطالب 

 
عنوان
صفحه
چکیده………………………………………………………………………………………………………..
د
فهرست مطالب……………………………………………………………………………………………..
ه
فهرست جدول­ها …………………………………………………………………………………………..
ی
فهرست شکل­ها…………………………………………………………………………………………….
ل
فصل اول 

 
1-1-مقدمه………………………………………………………………………………………………….
2
فصل دوم
2-1- آشنایی با سیمای استان ایلام……………………………………………………….……………
5
2-1-1- آب و هوای استان ایلام……………………………………………………..…….…………
5
2-2- جایگاه تاریخی نخود………………………………………………………………………..……
6
2-3- اهمیت و جایگاه نخود در جهان و ایران…………………………………..…………………
6
2-4- گیاه­شناسی نخود…………………………………………………………..………………………
7
2-4-1- انواع نخود……………………………………………………..……..…………………………
7
2-4-2- ارزش غذایی دانه نخود………………………………………………………………………
8
2-5- موقعیت زراعی نخود در استان ایلام……………………………………………………..……
8
2-6- بیماری­های نخود……………………………………………………………………….…….……
8
2-6-1- بیماری پژمردگی فوزاریومی نخود………………………………………………..………
9
2-6-2- جنس فوزاریوم …………………………………………………………………………………
10
2-6-2-1- طبقه­بندی فوزاریوم………………………………………..………………………………
10
2-6-2-2- نامگذاری و طبقه­بندی…………………………………………….………………………
11
2-6-2-3- مرحله زادآوری جنسی……………………………………………………………………
11
2-6-2-4- مرحله غیرجنسی……………………………………………………………………………
11
2-6-3- همه­گیری بیماری………………………………………………………………………………
12
2-6-3-1- علائم بیماری………………………………………………………………………………..
12
2-6-3-2- چرخه بیماری………………………………………….……………………………………
13
2-6-3-3- شرایط محیطی………………………………………………………………………………
14
2-6-3-4- گسترش بیماری………………………………………….…………………………………
14
2-7- روش­های کنترل بیماری پوسیدگی ریشه نخود……………………………………………
15
2-7-1- روش زراعی……………………………………………………….……………………………
15
2-7-2- روش شیمیایی………………………………………………..…………………………………
15
2-7-3- مبارزه بیولوژیکی………………………………………………………………………………
15
2-7-4- ارقام مقاوم……………….………………………………………………………………………
15
2-8- تنوع بیماری­زایی و تنوع ژنتیکی .Fusarium ssp…………………………………………
16
2-8-1- بررسی تنوع ژنتیکی F. oxysporum با استفاده از نشانگرهای ……………..SSR
17
فصل سوم    

 
3-1- نمونه­برداری…………………………………………………………………………………………
24
3-2- جداسازی قارچ عامل بیماری از بافت­های گیاهی آلوده…………………………………
32
3-3- محیط کشت­های مورد استفاده…………………………………………………………………
32
3-3-1- محیط کشت­های جداسازی…………………………………………………………………
32
3-3-1-1- محیط کشت سیب­زمینی- دکستروز- آگار…………………………………………
32
3-3-1-2- محیط کشت پپتون- پنتاکلرونیتروبنزن- آگار………………………………………
33
3-3-2- محیط کشت­های خالص­سازی………………………………………..……………………
34
3-3-2-1- محیط کشت آب- آگار……………………………….…………………………………
34
3-3-3- محیط کشت­های شناسایی……………………………………………………………………
34
3-3-3-1- محیط کشت برگ میخک- آگار…………………………………..…………………
34
3-3-3-2- محیط کشت مواد غذایی خاص…………………..……………………………………
35
3-4- شناسایی قارچ عامل بیماری…………………………..…………………………………………
35
3-5- تهیه کشت خالص و نگهداری جدایه­ها………………………………………………………
36
3-5-1- روش تک اسپور کردن ………………………………………………………………………
36
3-5-2- روش نوک­هیف……………………………………………………….………………………
36
3-5-3- نگهداری کشت خالص قارچ……………………….………………………………………
37
3-6- محلول­های رنگی مورد استفاده برای رنگ­آمیزی و مشاهده­ی قارچ…………………
37
3-6-1- محلول اریتروزین………………………………………………………………………………
37
3-6-2- محلول آبی پنبه در آب………………………………………………………………………
37
3-7- بررسی آزمون بیماری­زایی در گلخانه………………..………………………………………
38
3-8- آزمایش­های مولکولی……………………………………………….…..………………………
38
3-8-1- استخراج DNA ……………………………………………………………………….………
38
3-8-1-1- مراحل استخراج DNA …………………………………………..………………………
39
3-8-2- بررسی کیفیت استخراج………………………………………………………………………
40
3-9- بررسی تنوع ژنتیکی جدایه­ با کمک نشانگرهای SSR……………………………..……
41
3-10- تجزیه و تحلیل داده­ها ………………………………………………….………………………
43
فصل چهارم 

 
4-1- نتایج جداسازی جدایه­ها………………………………………….………………………………
45
4-1-1- مشخصات قارچ در محیط کشت PDA…………………….……………………………
45
4-2- آزمون بیماری­زایی………………..………………………………………………………………
46
4-3- نتایج تجزیه و تحلیل داده­های مولکولی……………………………………………..………
47
4-3-1- توزیع فراوانی آلل­ها در جمعیت­ها و جایگاه­های ریزماهواره……………….………
47
-3-2- ویژگی آغازگرهای استفاده شده برای جدایه­ها………………….………………………
48
4-3-3- آزمون مانتل………………………………………..……………………………………………
51
4-3-4- گروه­بندی جدایه­های F. oxysporum……………………..……………………………
52
4-3-5- تجزیه به مختصات اصلی در جدایه­های F. oxysporum مورد مطالعه………..…
55
4-4- تنوع ژنتیکی جمعیت­ها……………………………………………………..……………………
57
4-4-1- اطلاعات تنوع ژنتیکی پنج جایگاه SSR برای جمعیت­ها……………….……………
57
4-4-2- درصد چندشکلی در جمعیت­های مورد مطالعه…………………………………………
58
4-4-3- بررسی فاصله ژنتیکی و شباهت ژنتیکی در جمعیت­ها………………………..………
58
4-4-5- بررسی میزان جریان ژنی در جمعیت­ها……………………………………………………
60
4-4-6- تجزیه به مختصات اصلی و رسم بای­پلات بر اساس نشانگر SSR…………………
60
4-4-7- تجزیه واریانس مولکولی………………………………………………….…………………
61
4-5- بحث…………………………………………………………………………….……………………
62
4-5-1- نتیجه­گیری کلی……………………………..…..……………………….……………………
65
 

/>4-7- پیشنهادات……………………………………………………………..….…………………………
66
فهرست منابع……………………………………………………………………………………..…………
67
  

فهرست جدول­ها

 
عنوان و شماره
صفحه
جدول 3-1- مشخصات جدایه­های بدست آمده از مناطق مختلف……………………………
25
جدول 3-2- اجزای محیط کشت پپتون-پنتاکلرونیتروبنزن- آگار……………………….……
33
جدول 3-3- مواد تشکیل دهنده محیط کشت مواد غذایی خاص…………………….………
35
جدول 3-4- ترکیبات بافر استخراج DNA…………………………………………………………
39
جدول 3-5- مشخصات آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده…………………………………
42
جدول 4-1- توزیع فراوانی آلل­ها در جمعیت­ها…………………………………………..………
48
جدول 4-2- ویژگی­های آغازگرهای استفاده شده…………………………………………….…
48
جدول 4-3- شاخص نشانگری، نسبت چندگانه مؤثر و میزان چندشکلی (PIC) …………
49
جدول 4-4- اطلاعات مربوط به آلل­های موجود………………………………………….………
50
جدول 4-5- ضمیمه (شکل4-8) ………………………………………………..……………………
55
جدول 4-6- تخمین تنوع ژنتیکی در جمعیت­ها……………………………………………………
57
جدول 4-7- درصد چندشکلی در جایگاه­های ژنی………………………………………………
57
جدول 4-8- اندازه، مشخصات و فاصله ژنتیکی بین زوج جمعیت­ها…………………………
59
جدول 4-9- میزان جریان ژنی (Nm) و تمایز ژنتیکی GST در جمعیت­ها…………………
60
جدول4-10- خصوصیات مؤلفه­های حاصل از تجزیه به مختصات اصلی……………..……
61
جدول 4-11- تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) داده­ها……………….…………………
62 

 
فهرست شکل­ها 

 
عنوان و شماره
صفحه
شکل 2-1- چرخه بیماری زردی و پژمردگی نخود………………………………………………
13
شکل 3-1- موقعیت جغرافیایی مناطق نمونه­برداری شده……………..…………………………
24
شکل 3-2- نمونه های آلوده به بیماری زردی و پژمردگی……………………………………
25
شکل 3-3- بررسی کیفیت DNA ژنومی……………………………………………………………
41
شکل 4-1- پرگنه قارچ F. oxysporum f. sp. ciceri در محیط کشت PDA……..……
45
شکل 4-2- تصاویر میکروسکوپی قارچ F. oxysporum f. sp. ciceri…………….………
46
شکل 4-3- آزمون بیماری­زایی…………………………..……………………………………………
47
شکل 4-4- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR1………………………………
50
شکل 4-5- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR2………………………………
51
شکل 4-6- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR9………………………………
51
شکل 4-7- آزمون مانتل…………………………………………………………………………………
52
شکل 4-8- دندروگرام ارتباط ژنتیکی به روش UPGMA ……………………………………
53
شکل 4-9- دندروگرام ارتباط ژنتیکی به روش الحاق مجاور………………………….………
54
شکل4-10- نمودار دوبعدی تجزیه به مؤلفه­ اصلی…………………..……………………………
56
شکل 4-11- نمودار سه بعدی تجزیه به مؤلفه­های اصلی…………………………..……………
56
شکل 4-12- دندروگرام ارتباط ژنتیکی ایجاد شده بوسیله UPGMA ………..……………
59
شکل 4-13- نمودار دوبعدی پراکنش جمعیت­ها……………………………………….…………
60
شکل 4-14- نمودار مربوط به تجزیه واریانس مولکولی جمعیت­ها…………….……………
62
مقدمه

نخود زراعی (Cicer arietinum L.) گیاهی خودگشن، دیپلوئید (2n=2x=16)، یکساله با ژنوم کوچک738mbp) ~) می­باشد [27]. نخود مهم­ترین گیاه از خانواده حبوبات در حوزه مدیترانه، شبه قاره هند ، غرب آسیا و شمال آفریقا است [57]. اصلی­ترین كشورهای تولید­كننده نخود در جهان به ترتیب هند، پاكستان، تركیه، ایران و استرالیا هستند [48].

نخود، منبع بسیار مناسبی برای روی، آهن و پروتئین است. همچنین به لحاظ میزان فیبرهای رژیمی، بسیار غنی بوده و میزان چربی اندكی دارد که از نوع اسید­های چرب غیر­اشباع می­باشد، انواع نخود به طور متوسط دارای 19 درصد پروتئین، 13 درصد چربی و 68 درصد كربوهیدرات می­باشند، همچنین به لحاظ تأمین میزان كلسیم مورد نیاز نیز حائز اهمیت است [96]. سطح زیر كشت نخود در ایران 640 هزار هكتار و تولید سالیانة آن در حدود 400 هزار تن است [85، 59، 29]. طبق آمارهای انتشار یافته از سوی سازمان خوار و بار جهانی میزان تولید جهانی این محصول در سال 2010 میلادی 10 میلیون تن بوده که سهم ایران از آن حدود 233686 تن بوده است [45].

قارچ Fusarium oxysporum یک پاتوژن خاکزاد با دامنه میزبانی وسیع بوده كه باعث پژمردگی آوندی در گیاهان مختلف می­شود [26]. بیماری پژمردگی فوزاریومی نخود با عاملF. oxysporum f. sp.