2-3) سلمکChenopodium amaranticolor
59
2-4) توتون Nicotiana glutinosa L
60
2-5) توتون Nicotiana tabacum. cv. White Burley
60
2-6) توتون Nicotiana tabacum. cv. Samsun
61
2-7) گوجه فرنگی Lycopersicum esculentum Mill
61
2-8) لوبیا Phaseolus vulgaris L.cv. Bountiful
61
2-9) باقلا. Vicia faba
61
2-10) ماش. Vicia sativa L.
62
2-11) دامنه میزبانی و علائم
62
3- درجه حرارت غیر فعال شدن (TIP)
63
4- آخرین حد رقت (DEP)
63
5- پایداری ویروس در شرایط آزمایشگاه (LIV)
63
6- مطالعه روش های انتقال
63
6-1) انتقال با سس
63
6-2) انتقال با تماس
63
7- خالص سازی
63
7-1) روشShepard, 1972
63
7-2) روشFribourg,1975
64
7-3) روشMoreira, 1980
65
8- تعیین پراکنش ویروس بر اساس آزمون الایزاELISA
65
9- بررسی خصوصیات مولكولی
72
9-1) نتایج حاصل از استخراج آر.ان.ای كل گیاه (RNA Extraction)
72
9-2) نتایج واکنش رونوشت برداری برگردان زنجیره­ای پلی­مراز
(RT-PCR)
73
10) آنالیز تبازایی
74
 

فصل چهارم:بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات
76
فهرست منابع فارسی
84
فهرست منابع انگلیسی
85
چکیده انگلیسی
96
فهرست جداول
 
 
عنوان
صفحه
 
جدول1-1 اسامی ویروس های سیب زمینی
  

18
 
جدول 1-2 مقایسه بین ELISA, PCR, IC-PCR, RT-PCR-ELISA
35
 
جدول1-3 توالی آغازگرهای استفاده شده برای سنتز cDNA جهت ردیابی ویروس ایكس سیب­زمینی
37
 
جدول2-1 منطقه و تعداد نمونه های جمع آوری شده از مزارع سیب زمینی در همدان
42
 
جدول2-2 گیاهان میزبانی که برای مایه زنی ویروس ایکس سیب زمینی استفاده شد
45
 
جدول2-3 آغازگرهای استفاده شده در آزمون RT-PCR
49
 
جدول2-4 لیست توالی‌های کامل پروتئین پوششی PVX موجود در بانك ژن كه برای مقایسه با جدایه‌های ایرانی مورد استفاده قرار گرفته‌اند
52
 
جدول3-1درصد نمونه های علائم دار جمع آوری شده از مزارع همدان
57
 
جدول3-2 علائم ویروس ایکس بروی گیاهان محک
62
جدول 3-3 درصد آلودگی به چهار ویروس PVX، PVY، PVS و PLRV در مناطق بهار، رزن و کبودرآهنگ
65
 
جدول3-4 درصد آلودگی همزمان در مزارع استان همدان
66
 
فهرست نمودارها
 
عنوان
صفحه
نمودار1-1 توزیع میزان تولید سیب زمینی در استانهای كشور
16
نمودار3-1(Shepard, 1972) Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation
64
نمودار3-2(Fribourg,1975)   Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation
64
نمودار3-3 Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation(Moreira,1980)
65
نمودار3-4 نمودار 3-4درصد آلودگی در مزارع سیب زمینی منطقه بهار
68
نمودار3-5 درصد آلودگی در مزارع سیب زمینی در منطقه رزن
69
نمودار3-6 درصد آلودگی مزارع سیب زمینی در منطقه کبودر آهنگ
71
نمودار3-7 درصد آلودگی ویروس های سیب زمینی در مزارع سیب زمینی استان همدان
72
  فهرست اشکال
 
عنوان
صفحه
شكل1-1 ویروس PVX همراه با ویروس TMV حالت هم افزایی داشته و علائم شدید Double streak را ایجاد می­ کند
21
شكل1-2 گیاه سیب زمینی آلوده به ویرو س ایكس سیب زمینی با علائم موزاییك
22
شکل1-3 مدل حرکت Potexivirus
26
شكل1-4 مقایسه حساسیت روش های RT-PCR(A) و DAS-ELISA (B) برای ردیابی ویروس ایکس سیب زمینی
34
شکل 3-1 علائم موزائیک و نکروز در بوته سیب زمینی آلوده به دو ویروس ایکس و وای سیب زمینی
57
شکل 3-2 نمونه گوجه فرنگی مشکوک به علائم ویروسی
58
شکل3-3 لکه های نکروز، 15 روز پس از مایه زنی عصاره حاویPVX روی گل تکمه ایی
58
شکل3-4 لکه های سبز روشن پس از 10 روز مایه زنی عصاره حاویPVX روی داتوره
59
شکل3-5 ظهور لکه های سبزرد( کلروتیک) (سمت راست) و سپس سیستمیک در گیاه سلمک (سمت چپ)
59
شکل3-6 لکه­های سبزرد (کلروتیک) و موزاییک روی برگ N.glutinosa L مایه زنی شده توسط عصاره حاویPVX
60
شکل3-7علائم پیسك (ماتل)و رگبرگ روشنی روی Nicotiana tabacum. cv.White Burley مایه زنی شده توسط جدایه PVX
60
شکل3-8 علائم لكه های كلروز و نكروز سیستمیك در گیاه گوجه فرنگی 12 روز بعد از مایه زنی توسط PVX
61
شکل3-9 علائم زردی و موزائیک روی برگ­های ماش مایه زنی شده توسط عصاره حاویPVX
62
شکل3-10 عکس از باند حاصل شده ازRNA استخراج شده بروش Tri-Reagent
73
شكل 3-11 الكتروفورز محصولات PCR مربوط به تكثیر پروتئین پوششی با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی، در ژل آگاروز یك درصد
74
شکل 3-12 درخت تبارزایی جدایه‌های ایرانی PVX با سایر جدایه‌ها كه با روش NJ و 100 مرتبه bootstrap بدست آمده است.
75
 چکیده:

ویروس ایکس سیب­زمینی (Potato virus X- PVX) گونه شاخص جنس Potexvirus از خانواده Alfaflexiviridae می­باشد. طی سال های 1389 و 1390، از مناطق کشت اصلی سیب زمینی در استان همدان بازدید و نمونه برداری انجام گرفت. مجموعاً 456 نمونه برگی (تعداد 132 و 324 نمونه بترتیب علائم­دار و تصادفی) از 9 مزرعه واقع در مناطق بهار، کبودرآهنگ و رزن جمع آوری گردید. نتایج آزمون الایزا با بهره گرفتن از آنتی بادی اختصاصی (بیوربا-سویس) نشان دهنده آلودگی 42 نمونه با ویروس ایکس سیب زمینی بود. بر اساس آزمون الایزا میزان وقوع آلودگی به این ویروس به ترتیب کاهش در مناطق بهار، رزن و کبودرآهنگ تعیین گردید. برای تایید نتایج حاصل از آزمون سرولوژیکی از روش های بیولوژیکی و مولکولی استفاده شد. مطالعه دامنه میزبانی جدایه های ایرانی ویروس ایکس سیب زمینی با بهره گرفتن از گیاهان محک مختلف، تفاوتی نشان داد. همچنین در این تحقیق ناحیه ژن پروتئین پوششی ویروس بطول حدود 750 جفت باز با بهره گرفتن از آغازگر های اختصاصی تکثیر گردید. آنالیز تبارزایی با بهره گرفتن از توالی کامل پروتئین پوششی دو جدایه ویروس شامل Iran H1 و Iran H2 با توالی‌های مربوط به جدایه های خارجی PVX موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه های ایرانی در گروه اروپا-آسیا (Eurasia) قرار می گیرند. در درخت تبارزایی جدایه های تعیین توالی شده در این بررسی با جدایه ویروس ایکس جدا شده از نخود (Pisum sativum) در یک شاخه

مستقل و نزدیک بهم قرار گرفتند. طول کامل توالی پروتئین پوششی 714 نوکلئوتید بود که پروتئینی با 237 اسیدآمینه تولید می نماید. این نتایج با نتایج بدست آمده در مورد سایر جدایه های این ویروس از مناطق دیگر دنیا مطابقت دارد. هر چند که جدایه های ایرانی مورد مطالعه در گروه اروپا-آسیا قرار می گیرند ولی هنوز مشخص نیست که آنها جدایه های غالب این ویروس در ایران باشند. برای این منظور لازم است تا جدایه های بیشتری از این ویروس از مناطق خاورمیانه و سایر کشورها تعیین توالی شوند. هر چند بر اساس مطالعات ما این اولین گزارش از آنالیز تبارزایی این ویروس جدا شده از سیب زمینی از ایران واقع در منطقه mid-Eurasia می باشد.

كلمات كلیدی: ویروس ایكس سیب زمینی، تبارزایی، ایران

مقدمه:

در بین گیاهان دو لپه، سیب­زمینی مهمترین محصول زراعی است که، پس از گندم، برنج و ذرت در رتبه چهارم جهانی قرار دارد (FAO, 2009). تولید سیب­زمینی در جهان طبق گزارشات سازمان خواروبار و کشاورزی ملل متحد (فائو) در سال 2009، معادل 314 میلیون تن بوده است (FAO, 2009).

طبق گزارشات فائو چین بالاترین رکورد تولید سیب­زمینی را در سال 2009 در جهان داشته است و بعد از آن به ترتیب روسیه و هند در مقام­های دوم و سوم و آمریکا در مقام چهارم قرار گرفته اند و ایران از نظر تولید سیب زمینی در مقام چهاردهم جهان و دوم خاورمیانه قرار می گیرد (FAO, 2009). تولید سیب زمینی در کشور ما از اهمیت خاصی برخوردار است و فائو تولید سیب زمینی ایران را در سال 2009 میلادی چهار میلیون و 107 هزار و 626 تن اعلام کرده است. استان همدان با 63/16در­صد اراضی تحت کشت سیب­زمینی کشور، در مقام نخست قرار دارد. میزان تولید سیب زمینی در این استان حدود نیم میلیون تن برآورد شده است (آمارنامه جهاد کشاورزی، 1388).

بر اساس اعلام فائو سطح زیر کشت سیب­زمینی در ایران در سال 2009 میلادی نسبت به سال 2008 با کاهش 2/13 درصدی به 153 هزار و 995 هکتار رسید (FAO ,2009).

بیماری­های ویروسی نقش مهمی در کاهش عملکرد سیب­زمینی دارند. در این بین ویروس ایکس سیب­زمینی (Potato virus X– PVX) موجب کاهش محصول سیب­زمینی از 10 تا 20 درصد میگردد، این موضوع نشان دهنده گسترش بیماریهای ویروسی در مزارع سیب­زمینی کشور و لزوم تدوین برنامه ­هایی برای مدیریت آنها می­باشد. اولین گام در تدوین