مقدمه. 2

فصل اول کلیات

1- ناباروری.. 4

1-1- علل ناباروری در مردان.. 4

1-2- رادیکال‌های آزاد. 5

1-2-1- تعریف و نحوه تشکیل رادیکال‌‌های آزاد. 5

1-2-2- نحوه عملکرد رادیکال‌های آزاد. 5

1-2-3- گونه­های فعال اکسیژن و نیتروژن.. 5

1-2-3-1- نقش­های بیولوژیک ROS.. 6

1-2-4- تولید و منبع رادیکال­های آزاد. 6

1-2-4-1- تولید ROS توسط اسپرماتوزوآی غیر طبیعی.. 7

1-2-4-2- تولید ROS توسط لکوسیت­ها 7

1-2-5- استرس اکسیداتیو. 8

1-2-5-1- مکانیسم عملکرد استرس اکسیداتیو. 8

1-2-5- اثرات استرس اکسیداتیو. 9

1-2-5-1- استرس اکسیداتیو و آسیب به DNA… 9

1-2-6-1-2- اهمیت سلامت DNA اسپرم. 11

1-2-6-2-استرس اکسیداتیو در اسپرم. 12

1-2-6-3- استرس اکسیداتیو و بیماری­های دیگر. 12

1-2-7- اثراتROS.. 13

1-2-7-1- پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم. 13

1-2-7-2- اثر روی تحرک اسپرم. 13

1-2-8-  ROS و استرس اکسیداتیو مایع منی.. 13

1-2-9-  ROS و ناباروری.. 14

1-2-10- آنتی اکسیدان­ها 15

1-2-10-1- نحوه عملکرد آنتی­اکسیدان­ها به دو روش طبقه بندی میشود: 16

1-2-11- اثرات آنتی­اکسیدان­ها 18

1-2-11-1- تاثیر بر تحرک اسپرم. 18

1-2-11-2- تاثیر بر روی کاهش آسیب­های بعد از انجماد اسپرم. 18

1-2-11-3- تاثیر آنتی­اکسیدان­ها در جلوگیری از آسیب بهDNA… 18

1-2-12- نقش آنتی­اکسیدان­ها (رباینده­های­بالقوهROS) دراسپرم. 19

3-1- ژنتیک و ناباروری مردان.. 20

1-3-1- ژن انتخابی مورد مطالعه. 21

1-4- اهداف: 22

1-5-فرضیات: 22

فصل دوم مروری بر مطالعات گذشته24

فصل سوم مواد و روش­ها

3-1- تعیین گروه­های آزمایشی.. 30

3-2- جمع آوری نمونه­ها و محل انجام آزمایش…. 30

3-3- القاء استرس اکسیداتیو با تزریق t-BHP.. 31

3-4-  تک سلول کردن بافت بیضه. 31

3-5- شمارش تعداد سلول­های زنده در بافت بیضه. 32

3-6-1- روش فلوسایتومتری.. 32

3-6-2-  سنجش ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری.. 34

3-7- روشهای تعیین آسیب DNA اسپرم. 35

3-7-1- تست TUNEL جهت ارزیابی شکست  DNAاسپرم. 36

3-7-2- جمع‌آوری سلول‌های اسپرمی جهت آنالیز شکستهای DNA اسپرم. 37

3-7-3-  محلولها و بافرهای مورد نیاز جهت روش TUNEL، به منظور ارزیابی شکست DNA اسپرم. 39

3-7-4- مراحل انجام آزمایش TUNEL.. 39

3-7-5- نحوه استفاده از کیت TUNEL.. 40

3-8-  بررسی بیان ژن Kdm5d یا Smcy. 40

3-8-1- استخراج RNA به روش ترایزول.. 41

3-8-2- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 42

3-8-3- تیمار کردن نمونه­های RNAی استخراج شده 43

3-8-4-  سنتزDNA  مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA… 44

3-8-5- روش انجام واکنش زنجیرهای پلی مراز (PCR) جهت اطمینان از سنتز cDNA… 46

3-8-6-روش تهیه­ی ژل آگارز و انجام الکتروفورز 48

3-8-7- طرز تهیه­ی محلول­ها 48

1- بافر50x TAE.. 48

2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml) 48

3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش واکنش زنجیرهای پلیمرازپیوسته. 49

3-8-8-1-روش Ct مقایس­های برای کمی سازی نسبی.. 50

3-8-6- آنالیز آماری.. 52

فصل چهارم نتایج   

4-1-  بررسی وزن بدن و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

4-2- بررسی ماکروسکوپی بافت بیضه. 55

4-3- بررسی میزان ROS در بیضه­ی گروه کنترل و آزمون.. 56

4-3-1- اندازه گیری میزان O2 و H2O2 56

4-4-  نتایج ارزیابی شکست DNA اسپرم با تست TUNEL.. 59

4-5- بررسی وضعیت بیانی ژن Kdm5d در بافت بیضه. 61

4-5-1- استخراج RNA کل از بافت بیضه. 61

4-5-2- بررسی صحت سنتز cDNA… 62

4-5-3- بررسی بیان کمی ژن Kdm5d در بافت بیضه. 63

فصل پنجم بحث و نتیجه­گیری

5-1- بحث و نتیجه گیری کلی.. 67

5-2- پیشنهادات: 70

منابع.. 71

خلاصه انگلیسی… 80

ضمائم.. 81

فهرست جداول

عنوان                                                                     صفحه

جدول 1-1: انواع آنتی­اکسیدان­ها و مکانیسم عملکرد آنها 17

جدول 3-1: ترکیب محیط TCM…. 38

جدول 3-2: ترکیب محیط 38

جدول 3-3: ژن مورد نظر و توالی پرایمر مورد استفاده 40

جدول 3-4: مواد مورد استفاده در تیمار نمونه­هایRNA… 43

جدول 3-5: مواد مورد استفاده در سنتزcDNA… 45

جدول 3-6: برنامه دمایی سنتز cDNA… 45

جدول 3-7: مواد مورد استفاده در RT-PCR… 47

جدول 3-8: برنامه دمایی RT-PCR و تعداد سیکل­های هر مرحله. 47

جدول 3-9: اجزای لازم برای انجام واكنش  Real-Time PCR… 51

جدول 3-10: برنامه دمایی Real-Time PCR… 51

جدول 4-1: میانگین وزن بدن در طول تزریق و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

جدول 4-2: میزان درصد H2O2 و O2 موجود در دو گروه کنترل و آزمون در نمونه­های بیضه­ای با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری.. 58

جدول 4-3: درصد شکست DNA اسپرم با روش TUNEL در گروه کنترل و آزمون.. 60

جدول 4-4: داده­های گزارش شده برای آنالیز کمی ژن Kdm5d.. 64

جدول 4-5: آنالیز نتایج  Real-Time PCR با استفاده از نرم افزار REST.. 64

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                صفحه

شکل 1-1: ارتباط بین  ATMو P53 در پاسخ­های ترمیم DNA یا آپوپتوز حاصل از آسیب ایجاد شده توسط استرس اکسیداتیو. 9

شکل 1-2: ارتباط بین افزایش تولید ROS با ناباروری.. 15

شکل 1-3: فشردگی کروماتین قبل از ورود به میوز توسط کمپلکس Smcy-MSH5.. 21

شکل 3-1: شمایی از لام نئوبار 32

شکل 3-2: DCFH-DA و مکانیسم عمل آن.. 34

شکل 3-3: روش­های ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آن­ها 36

شکل3-4: اساس روش TUNEL.. 37

شکل 4-1: نمونه­های بافت بیضه در موش­های کنترل و آزمون.. 56

 

شکل 4-2: ارزیابی آسیب DNA در نمونه آزمون با روش TUNEL با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت(1000×) 60

شکل 4-3: نمونه RNA­های استخراج شده از بافت بیضه. 62

شکل 4-4: محصولات RT-PCR. 63

شکل 4-5: منحنی تفکیک ژن مربوطه. 65

فهرست نمودار

عنوان                                                                                                 صفحه

نمودار 4-1: مقایسه وزن بدن و بافت بیضه میان گروه کنترل و آزمون. 55

نمودار 4-2: نمودار هیستوگرام از سلول­های بیضه­ای در یکی از نمونه­های گروه کنترل و آزمون.. 57

نمودار 4-3: نتیجه حاصل از بررسی میزان ROS (H2O2 و ̊O2) در نمونه­های بیضه بین دو گروه کنترل و آزمون  59

نمودار 4-4: نتیجه حاصل از بررسی میزان شکست DNA در نمونه­های اسپرم بین دو گروه کنترل و آزمون  61

نمودار 4-5: نمودار بیان نسبی ژنKdm5d. 65

 

چکیده
ناباروری عمده­ترین مشکل تولیدمثلی است که حدود 15درصد زوج های جوان در جهان را درگیر می­کند. این عارضه دلایل مختلفی دارد که فاکتورهای مردانه مسؤول 40 درصد این دلایل می­باشند. در بررسی دلایل ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو و فاکتورهای ژنتیکی نقش اساسی ایفا می کنند. گونه های اکسیژن فعال (ROS) می­توانند سبب افزایش استرس اکسیداتیوشوند. افزایش استرس اکسیداتیو می­تواند موجب اثرات مخربی بر روی عملکرد سیستم تولید مثل از جمله شکست DNA اسپرم و تغییر بیان ژن­های دخیل در اسپرماتوژنز شود.

در این تحقیق با استفاده ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید  t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن Kdm5d(Smcy) ایجاد گردید. این ژن در مرحله لپتوتن/زیگوتن میوز به کمک فاکتور ترمیمی MSH5سبب دمتیله شدن هیستون 3 لیزین 4 (H3K4) شده و در فشرده شدن کروماتین نقش مهمی داشت.پس از تعیین دوز  LD50برای  t-BHP، به میزان یک دهم آن به مدت 14 روز به موش­های نر بالغ Balb/c به صورت داخل صفاقی تزریق شد. سپس میزان ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری اندازه­گیری و میزان شکست DNA اسپرم با روش TUNEL سنجیده و بیان ژن Kdm5d  مورد ارزیابی قرار گرفت.

فلوسایتومتری افزایش استرس اکسیداتیو در موش­های گروه تیماری نسبت به گروه کنترل را نشان داد.  همچنین میزان شکست DNAدر موش­های گروه تیماری نسبت به گروه کنترل با آزمایش تانل به اثبات رسید. بیان ژن Kdm5d در گروه آزمون از طریق Real time PCR نشان داده شد. کاهش بیان ژن Kdm5d را می­توان به آسیب­های وارد شده به DNA و سایر مکانیزم­ها از جمله تغییرات اپی­ژنتیکی که می­توانند در بیان ژن­ها تاثیرگذار باشند، نسبت داد.

کلمات کلیدی: ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو، ژنKdm5d