پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست‏ شناسی
گرایش میکروبیولوژی
 
عنوان
بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای blaVIM  و blaNDM در اسینتوباکتربومانی های ایزوله شده از بیماران شهرتهران
 

استاد راهنما
دکتر رضا میرنژاد
 
دی‏ماه 93
 

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب
عنوان                                                                                                                        صفحه

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………. 1

فصل اول – مقدمه

1-1- بیان مسأله…………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-2- ضرورت انجام تحقیق………………………………………………………………………………………………. 3

1-3-اهداف پژوهش………………………………………………………………………………………………………… 4

1-4-فرضیه‏ها……………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-5-تعریف متغیرها………………………………………………………………………………………………………… 4

فصل دوم – مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1- تاریخچه جنس اسینتوباکتر بومانی………………………………………………………………………………… 6

2-2- تاکسونومی رایج اسینتوباکتر بومانی………………………………………………………………………………. 7

2-3- شناسایی گونه های اسینتوباکتر……………………………………………………………………………………. 7

2-4- جایگاه طبیعی اسینتوباکتر بومانی………………………………………………………………………………….. 8

2-5.فاکتورهای بیماری زایی اسینتوباکتر………………………………………………………………………………… 8

2-6.منشا کلینیکی عفونت های اسینتوباکتر بومانی…………………………………………………………………… 10

2-6-1.مننژیت…………………………………………………………………………………………………………….. 10

2-6-2.عفونت خون………………………………………………………………………………………………………. 10

2-6-3.عفونت های دستگاه ادراری…………………………………………………………………………………….. 10

2-6-4. پنومونی بیمارستانی…………………………………………………………………………………………….. 10

2-7. عفونت های بیمارستانی……………………………………………………………………………………………. 11

2-8. استراتژی های درمانی عفونت های اسینتوباکتر بومانی…………………………………………………………. 12

2-9. داروهای ضد میکروبی رایج………………………………………………………………………………………. 12

2-9-1. پلی میکسین ها………………………………………………………………………………………………….. 13

2-9-2.آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………………. 13

2-9-3.سولباکتام…………………………………………………………………………………………………………. 14

2-9-4. کینولون ها……………………………………………………………………………………………………….. 14

2-9-5.تتراسایکلین ها و تایگلیسین ها………………………………………………………………………………… 15

2-9-6.آنتی بیوتیک های بتالاکتام……………………………………………………………………………………… 15

2-9-6-1.پنی سیلین ها…………………………………………………………………………………………………. 15

2-9-6-2.کارباپنم ها……………………………………………………………………………………………………. 17

2-9-6-3.سفالوسپورین ها……………………………………………………………………………………………… 17

2-9-6-4. مونوباکتام ها………………………………………………………………………………………………… 18

2-9-7.دیگر درمان های ترکیبی………………………………………………………………………………………… 18

2-10.مکانیسم عمل آنتی بیوتیک های بتالاکتام………………………………………………………………………. 18

2-10-1.پنی سیلین ها…………………………………………………………………………………………………… 18

2-10-2.کارباپنم ها……………………………………………………………………………………………………… 19

2-10-3.سفالوسپورین ها……………………………………………………………………………………………….. 19

2-11.مکانیسم های مقاومت…………………………………………………………………………………………….. 20

2-11-1.مکانیسم های مقاومت آنتی بیوتیکی………………………………………………………………………… 20

2-11-2.مکانیسم های مقاومت به بتالاکتام ها………………………………………………………………………… 21

2-11-2-1. مکانیسم های آنزیمی……………………………………………………………………………………… 21

2-11-2-2.مکانیسم های غیر آنزیمی…………………………………………………………………………………. 21

2-12.طبقه بندی بتالاکتامازها…………………………………………………………………………………………… 22

2-13.بتالاکتامازهای باکتری های گرم منفی…………………………………………………………………………… 24

2-14.بتالاکتامازهای باکتری های گرم مثبت………………………………………………………………………….. 24

2-15.بتالاکتامازهای وسیع الطیف……………………………………………………………………………………… 24

2-16.خصوصیات آنتی بیوتیک های وسیع الطیف……………………………………………………………………. 25

2-17.حساسیت ESBL ها در مقابل آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………… 25

2-18.انواعESBL  ها……………………………………………………………………………………………………. 26

2-18-1.بتالاکتامازهای تیپ SHV……………………………………………………………………………………. 26

2-18-2.بتالاکتامازهای تیپ TEM…………………………………………………………………………………… 26

2-18-3.بتالاکتامازهای تیپ OXA…………………………………………………………………………………… 27

2–18-4.بتالاکتامازهای تیپCTX-M……………………………………………………………………………… 27

2-18-5. بتالاکتامازهای تیپ NDM(متالوبتالاکتاماز)……………………………………………………………… 27

2-18-6.بتالاکتامازهای تیپ VIM(متالوبتالاکتاماز)……………………………………………………………….. 28

2-19. فاکتور هایی که بر بیان بتالاکتامازها اثر می گذارند………………………………………………………….. 28

2-20.درمان عفونت های ایجاد شده توسط سویه های مولد ESBL……………………………………………… 29

2-21.کنترل……………………………………………………………………………………………………………….. 30

2-22.مثال هایی از مکانیسم های مقاومت به بتالاکتام ها……………………………………………………………. 30

2-22-1.مکانیسم مقاومت به کارباپنم ها……………………………………………………………………………… 30

2-22-2.مکانیسم مقاومت به پنی سیلین ها…………………………………………………………………………… 31

2-22-3.مکانیسم مقاومت به مونوباکتام ها…………………………………………………………………………… 32

2-22-4.مقاومت به آمینوگلیکوزیدها………………………………………………………………………………….. 32

2-22-5. مقاومت به پلی میکسین ها…………………………………………………………………………………… 33

2-22-6.مقاومت به کینولون ها…………………………………………………………………………………………. 33

2-22-7.مقاومت به تتراسایکلین ها و تایگلسین ها………………………………………………………………….. 33

2-23.مهارکنندگان بتالاکتامازها………………………………………………………………………………………… 34

2-23-1.مکانیسم عمل مهارکنندگان بتالاکتامازها……………………………………………………………………. 34

2-24.روش های شناسایی آنزیم های ESBL……………………………………………………………………….. 35

2-24-1-1.آزمایش مجاورت دو دیسک……………………………………………………………………………… 35

2-24-1-2.ترکیب دو دیسک……………………………………………………………………………………………

 

36

2-24-1-3.آزمایش سه بعدی………………………………………………………………………………………….. 36

2-25.شیوع بیمارستانی و ارزیابی میزان کنترل……………………………………………………………………….. 36

2-26.اپیدمیولوژی جهانی اسینتوباکتر بومانی…………………………………………………………………………. 37

2-27. روش مولکولی دخیل در بررسی باکتری های مولد آنزیم های بتالاکتاماز وسیع الطیف………………… 38

2-27-1. واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)………………………………………………………………………. 39

2-28.سوابق و پیشینه تحقیق……………………………………………………………………………………………. 41

 

فصل سوم – مواد و روش‏ها

3-1-وسایل موردنیاز…………………………………………………………………………………………………….. 37

3-2-مواد موردنیاز……………………………………………………………………………………………………….. 38

3-3-طریقه ساخت محیط های کشت………………………………………………………………………………….. 40

3-3-1.طرز تهیه محیط بلاد آگار(محیط پایه شرکت Merck )………………………………………………….. 40

3-3-2. طرز تهیه محیط نوترینت آگار (شرکت Merck)…………………………………………………………. 40

3-3-3. طرز تهیه محیط SIM(شرکت Merck )………………………………………………………………….. 41

3-3-4. طرز تهیه محیط مک کانکی آگار(شرکت Merck )……………………………………………………… 41

3-3-5. طرز تهیه محیط اوره براث(شرکت Merck )……………………………………………………………… 42

3-3-6. طرز تهیه محیط مولر هینتون آگار(شرکت Merck ):…………………………………………………………. 42

3-3-7. طرز تهیه محیط MRVP(شرکت Merck )………………………………………………………………….. 52

3-3-8. طرز تهیه محیط BHI براث(شرکت Merck)……………………………………………………………. 52

3-3-9. طرز تهیه محیط TSI(شرکت Merck ):………………………………………………………………….. 53

3-3-10. طرز تهیه محیط سیمون سیترات (شرکت Merck )……………………………………………………. 54

3-3-11. طرز تهیه محیط OF(شرکت Merck ):…………………………………………………………………………………….. 54

3-4. روش انجام این پژوهش…………………………………………………………………………………………… 55

3-4-1.جمع آوری نمونه………………………………………………………………………………………………… 55

3-4-2.جداسازی باکتری ها…………………………………………………………………………………………….. 55

3-4-3. نگه داری باکتری ها در 80- درجه سلسیوس………………………………………………………………. 57

3-5.آنتی بیوگرام………………………………………………………………………………………………………….. 57

3-5-1-تهیه سوسپانسیون باکتریایی…………………………………………………………………………………………. 57

3-5-2-روش آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………… 58

3-6.استخراج ژنوم به روش جوشاندن…………………………………………………………………………………. 59

3-7. اندازه گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده……………………………………………………………… 59

3-8. الکتروفورز محصول استخراج ژنوم………………………………………………………………………………. 59

3-9.مواد و وسایل مورد نیاز برای اجرای PCR……………………………………………………………………… 59

3-9-1.DNA الگو………………………………………………………………………………………………………. 59

3-9-2.Master Mix…………………………………………………………………………………………………. 60

3-9-3.پرایمر……………………………………………………………………………………………………………… 60

3-9-4.محلول کار پرایمر PCR……………………………………………………………………………………….. 61

3-10.روش اجرا PCR………………………………………………………………………………………………….. 61

3-11.مواد و وسایل مورد نیاز برای اجرای الکتروفورز………………………………………………………………. 63

3-11-1.بافرTBE 5X………………………………………………………………………………………………….. 63

3-11-2.بافر TBE 1X…………………………………………………………………………………………………. 63

3-11-3.ژل آگارز 5/1 درصد…………………………………………………………………………………………. 63

3-12.روش انجام الکتروفورز…………………………………………………………………………………………… 64

3-13.تعیین توالی…………………………………………………………………………………………………………. 64

فصل چهارم – نتایج و بحث

4-1.جداسازی، کشت، تشخیص نمونه های باکتری………………………………………………………………….. 65

4-1-1. درصدو تعداد گونه های مختلف موجود در نمونه های جدا شده از بیماران…………………………….. 65

4-1-2. نتایج تست های افتراقی برای گونه های اسینتوباکتر بومانی……………………………………………….. 67

4-1-3. تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن…………………………………………………… 67

4-1-3-1.نتایج حاصل از روش دیسک دیفیوژن برای تمام ایزوله های اسینتوباکتر بومانی…………………….. 67

4-1-3-2. تهیه الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی………………………………………………………………………… 69

4-2.استخراج DNA……………………………………………………………………………………………………… 72

4-3.نتایج بدست آمده در بررسی ژن کد کننده آنزیمblaVIM…………………………………………………… 73

4-4.نتایج بدست آمده در بررسی ژن کدکننده آنزیم blaNDM………………………………………………….. 74

4-5:.بحث………………………………………………………………………………………………………………….. 76

 

فصل پنجم – نتیجه‏گیری

5-1- نتیجه‏گیری………………………………………………………………………………………………………….. 80

5-2-پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………… 82

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………. 83

چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………. 94

 

فهرست جدول‏ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

جدول2-1:طبقه بندی بتالاکتامازها در باکتری های گرم منفی………………………………………………………………………….. 23

جدول شماره 3-1: ترکیبات پایه ی محیط بلاد آگار………………………………………………………………………………………… 49

جدول شماره 3-2: ترکیبات محیط نوترینت آگار…………………………………………………………………………………………….. 49

جدول شماره 3-3: ترکیبات محیط SIM……………………………………………………………………………… 50

جدول شماره 3-4: ترکیبات محیط مک کانکی آگار…………………………………………………………………. 50

جدول شماره 3-5: ترکیبات محیط اوره براث………………………………………………………………………… 51

جدول شماره 3-6: ترکیبات محیط مولر هینتون آگار………………………………………………………………… 51

جدول شماره 3-7: ترکیبات محیط MRVP………………………………………………………………………….. 52

جدول شماره 3-8: ترکیبات محیط BHI براث……………………………………………………………………….. 52

جدول جدول شماره 3-9: ترکیبات محیط TSI……………………………………………………………………….. 53

جدول جدول شماره 3-10: ترکیبات محیط سیمون سیترات……………………………………………………….. 54

جدول شماره 3-11: ترکیبات محیط OF……………………………………………………………………………… 55

جدول شماره 3-12:خلاصه نتایج حاصل از محیطOF………………………………………………………………. 56

جدول شماره3-13:توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه………………………………………………….. 60

جدول شماره 3-14: محلول کاری پرایمر…………………………………………………………………………….. 61

جدول شماره3-15: ترکیب واکنش PCR برای هر نمونه…………………………………………………………….. 62

جدول شماره3-16: برنامه انجام واکنش PCR برای ژن VIM……………………………………………………… 62

جدول شماره 3-17 برنامه انجام واکنش PCR برای ژن NDM……………………………………………………. 62

جدول شماره3-18: طرز تهیه بافر TBE 5X…………………………………………………………………………… 63

جدول شماره 4-1 : فراوانی اسینتوباکتر بومانی در نمونه کلینیکی مورد بررسی………………………………….. 66

جدول شماره 4-2: خصوصیات بیو شیمیایی اسینتوباکتر بومانی……………………………………………………. 67

جدول شماره 4-3: نتایج حساسیت اسینتوباکتر بومانی به دیسک های آنتی بیوتیکی در نمونه های کلینیکی مورد بررسی       68

جدول شماره 4-4 : الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در اسینتوباکتر بومانی………………………………………….. 70

 

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                        صفحه

نمودار شماره 4-1: فراوانی سویه های اسینتوباکتر در نمونه های کلینیکی مورد بررسی………………………… 66

نمودار شماره 4-2 : درصد مقاومت مشاهده شده در بین ایزوله های جدا شده از بیماران………………………. 69

نمودار شماره4-3: درصد فراوانی ژن های VIM,NDMمورد مطالعه در اسینتوباکتر بومانی های ایزوله شده از بیماران        75

 

فهرست شکل‏ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

شکل 4-1: بررسی کیفی .الکتروفورز نمونه‌های DNA  استخراج شده با روش جوشاندن بر روی ژل آگارز 1 72

شکل 4-2: بررسی کمی. نتایج اندازه گیری غلظت DNA استخراجی با روش جوشاندن با دستگاه نانودراپ در طول موج 260 نانومتر……….72

شکل شماره 4-3: الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلی فایل شده ی ژن blaVIM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR            73

شکل شماره 4-4 :الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلی فای شده ی ژن blaNDM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR    

چکیده:

مقدمه : در حال حاضر بتالاکتام ها به عنوان داروی انتخابی در درمان عفونت های اسینتوباکتر بومانی مقاوم به چند دارو استفاده می گردد هرچند مقاومت به این عوامل رو به افزایش می باشد. این باکتری با مکانیسم های مختلف از جمله تولید بتالاکتامازها به این داروها مقاومت نشان می دهند. متالوبتالاکتاماز دارای تیپ های مختلفی می باشند که که در بین آنها blaVIM و  blaNDMاز همه بارزتر است .با توجه به اینکه در شهر تهران میزان فراوانی ژن فوق در اسینتوباکتر بومانی مشخص نمی باشد این مطالعه با هدف بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای هایblaVIM و blaNDM در اسینتوباکتر بومانی های ایزوله شده از بیماران شهر تهران به روش مولکولی اجرا گردید.

روش کار: این مطالعه برروی 500 نمونه بالینی جمع آوری شده از 3 بیمارستان شهر تهران طی مدت دو سال انجام گردید. پس از جمع آوری نمونه ها با بهره گرفتن از روش های کشت و بیوشیمیایی گونه اسینتوباکتر بومانی شناسائی گردید. سپس تست حساسیت آنتی بیوتیکی بر روی این  ایزوله ها با روش دیسک دیفیوژن بر اساس دستور CLSI انجام گردید. در نهایت برای بررسی فراوانی ژن های blaVIM و blaNDM با بهره گرفتن از پرایمرهای اختصاصی PCR انجام شد.

نتایج:  با توجه به نتایج غربالگری اولیه، بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی در 100 ایزوله اسینتوباکتر بومانی مربوط به آنتی بیوتیک های سفی پیم و کمترین مقاومت مربوط به پلی میکسین B بدست آمد. نتایج PCR نشان داد که به ترتیب 17% و 20%، سویه ها حامل ژن های blaVIM و  blaNDMمی باشند.

بحث:  این مطالعه نشان  داد که ژنهای کدکننده blaVIM و blaNDMدر حال گسترش در بین سویه های بالینی اسینتوباکتر بومانی بوده، لذا شناسایی ژنهای فوق با بهره گرفتن از روش مولکولیPCR که روشی سریع و مقرون به صرفه است برای جلوگیری از انتشار عفونت در بیمارستان های شهر تهران پیشنهاد می شود.

کلمات کلیدی: اسینتوباکتر بومانی، بتالاکتامازهای وسیع الطیف، دیسک ترکیبی، VIM، NDM، PCR

فصل اول  

مقدمه

1-1-بیان مسئله

اسینتوباکتربومانی از پاتوژن های فرصت طلب در حال گسترش بوده، این باکتری یک باسیل گرم منفی، غیر متحرک، غیر تخمیری، پلی مورف، هوازی اجباری و معمولا کپسول دار است که بر روی محیط های معمولی آزمایشگاهی به آسانی رشد می کند . اندازه کلنی بین 1 تا 2 میلی متر، بدون پیگمان و صاف تا موکوئیدی است. در مرحله رشد لگاریتمی شکل باسیل دارند، ولی در مرحله سکون به صورت کوکوباسیل دیده می شوند اسینتوباکتر بومانی اکسیداز منفی هستند، توانایی احیای نیترات را ندارند، همچنین اندول منفی و کاتالاز مثبت می باشند. بر روی محیط آگار خون دار معمولا همولیز ایجاد می کنند و در دمای 44 درجه سلسیوس رشد   می کنند.

این باکتری ها در روی سطوح خشک تا مدت ها زنده باقی می مانند. مقاومت بالای این باکتری نسبت به شرایط محیطی (11روز در رطوبت نسبی 31 درصد، 4 روز در رطوبت نسبی 10 درصد) امکان حضور این باکتری را در محیط های بیمارستانی افزایش داده است. این ارگانیسم به عنوان فلور نرمال در پوست و دستگاه تنفسی افراد سالم وجود داشته و در سال های اخیر به عنوان یک عامل مهم در عفونت های بیمارستانی گزارش شده است. با وجود اینکه این باکتری معمولا از ویرولانس پائینی برخوردار است، اما می تواند طیف وسیعی از عفونت ها نظیر باکتریمی، سپتی سمی و پنومونی همچنین عفونت خون در بیماران دچار سوختگی با ضعف سیستم ایمنی را ایجاد نماید. اسینتوباکتر بومانی بیشترین عامل ایجاد کننده عفونتهای بیمارستانی به ویژه در بخش مراقبت های ویژه می باشند که نسبت به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها مقاومت نشان می دهند. اگرچه سویه های اسینتوباکتر بومانی معمولا در آب و خاک یافت می شوند، ولی منشا سویه های اپیدمیک مقاومت به چند دارویی آن از بیمارستان می باشد و این سویه ها از لحاظ ژنتیکی بسیار شبیه هم هستند. ریسک فاکتورهای مهم آن مصرف طولانی مدت آنتی بیوتیک، اقامت طولانی در بخش مراقبت های ویژه (ICU) و بیماری های جدی می باشد.

اسینتوباکتر بومانی به عوامل ضد میکروبی بسیار مقاوم است که این مقاومت می تواند ذاتی و یا از طریق بدست آوردن عوامل ژنتیکی مقاومت باشد. درمان عفونت های اسینتوباکتر اغلب در مواردی که فنوتیپ مقاومت، چند دارویی است مشکل می باشد. این مقاومت ها اغلب با واسطه ژن هائی صورت می گیرد که بر روی عناصر ژنتیکی متحرک مثل ترانسپوزون ها و اینتگرون ها قرار داشته و به سادگی در میان باکتری ها انتشار می یابند. در حال حاضر بتالاکتام ها به عنوان داروی انتخابی در درمان عفونت های اسینتوباکتر بومانی مقاوم به چند دارو استفاده می گردد، هرچند مقاومت به این عوامل رو به افزایش می باشد.

این باکتری با مکانیسم های مختلف به این داروها مقاومت نشان می دهند که می توان به موارد زیراشاره کرد. یکی از این عوامل ایجاد کننده مقاومت تولید متالوبتالاکتاماز می باشد. متالوبتالاکتامازها قادر به هیدرولیز طیف وسیعی از بتالاکتام ها از جمله پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها و کارباپنم ها هستند، اما توانایی هیدرولیز مونوباکتام ها (آزترونام) را ندارند. متالوبتالاکتاماز بر اساس ساختار مولکولی به شش نوع تقسیم می شود که شامل ژنهای:AIM,NDM ,SPM ,SIM ,GIM ,IMP ,VIM هستند که در بین آنها VIM