دکتر کیارش قزوینی
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب:

1 مقدمه…………………………… 1

1-1 اهمیت موضوع……………………………. 1

1-2 اهداف تحقیق…………………………….. 4

2 بررسی منابع…………………………….. 5

2-1 مکمل‌ها و غذاهای عمل گرا…………………………… 5

2-1-1 تفاوت غذای عمل گرا و مکمل غذائی…………………… 6

2-2 ایمنوگلوبین Y…………………………….

2-2-1 ایمنوگلوبین زرده ی تخم مرغ (IgY)……………………. 7

2-2-2 ویژگی‌ها…………………………… 9

2-2-3 کاربرد‌های بیوآنالایتیک……………………………… 9

2-2-4 استفاده در مواد غذائی…………………………….. 10

2-3 هلیکو باکتر پیلوری………………………….11

2-3-1 علائم و نشانه‌ها…………………………… 11

2-3-2 میکروبیولوژی…………………………….. 12

2-3-3 ژنوم……………………………. 13

2-3-4 زیرواحد CagA هلیکوباکتر پیلوری………………….. 14

2-3-5 نقش CagA در سرطان……………………………. 15

2-3-6 پاتوفیزیولوژی…………………………….. 15

2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم……………………………. 16

2-3-8 جزیره بیماریزائی Cag……………………………..

2-3-9 سرطان……………………………. 18

2-3-10 آسیب شناسی…………………………….. 19

2-3-11 پیشگیری…………………………….. 19

2-3-12 درمان……………………………. 20

2-3-13 پیش بینی بیماری…………………………….. 21

2-3-14 بقاء هلیکوباکتر پیلوری…………………………….. 22

2-3-15 همه گیر شناسی باکتری (Epidemiology)………….. 24

2-4 آنتی ژن‌ها……………………………25

2-4-1 ساختمان آنتی ژن……………………………. 25

2-5 اپی توپ‌ها…………………………… 26

2-5-1 انواع اپی توپ‌ها…………………………… 26

2-5-2 عملکرد……………………………. 27

2-5-2-1 اپی توپ‌های سلول T……………………………..

2-5-3 واکنش متقاطع……………………………..28

2-5-4 نقشه برداری اپی توپ فضائی…………………………….. 28

2-5-5 نشانه‌های اپی توپ……………………………… 28

2-6 تحقیقات انجام شده در این زمینه……………………………. 29

2-7 ابزار‌های مورد استفاده…………………………… 38

2-7-1 دات بلاتینگ……………………………… 38

2-7- 2 نرم افزار CLC Work Bench5…………………………….

2-7-3 نرم افزار Mega5…………………………….

2-7-4 ابزار BLAST……………………………..

3 مواد و روش‌ها…………………………… 40

3-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA……………………………..

3-2 تهیه باکتری هلیکو باکتر پیلوری…………………………….. 41

3-3 استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……41

3-3-1 تعیین کمیت و کیفیت DNA با ژل آگارز……………………. 41

3-4 تعیین غلظت DNA استخراج شده…………………………… 42

3-5 طراحی آغازگرها…………………………… 42

3-6 انجام واکنش PCR……………………………..

3-7 خالص سازی محصول PCR……………………………..

3-7-1 بررسی بر روی ژل الکتروفورز……………………………. 45

3-8 طرز تهیه محلولهای مورد استفاده در کلونینگ……………… 45

3-8-2 محلول غلیظ آنتی بیوتیک آمپیسیلین……………………. 46

3-8-3 محلول غلیظ IPTG  (0. 1M)…………………………….

3-8-4 محلول غلیظ X-Gal  (20mg/ml)…………………………….

3-8-5 محیط کشت LB مایع…………………………….. 46

3-8-6 محیط کشت LB-Agar جامد……………………………. 47

3-9-2 هضم pET-32a  (+)…………………………….

3-9-3 خالص سازی pET-32a  (+) و قطعه هدف………………… 49

3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده…………………………… 50

3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CagA با pET-32a  (+)………..

3-9-6 جوان سازی باکتری DH5α……………………………..

3-9-7 تهیه سلول‌های مستعد DH5α……………………………..

3-9-8 انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری…………………………….. 52

3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب………………. 53

3-9-10 کلونی PCR……………………………..

3-9-11 استخراج پلاسمید نوترکیب……………………………… 54

3-9 -12 تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی………………………. 55

3-10 توالی یابی…………………………….. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3)……..

3-12 تحریک بیان ژن هدف……………………………… 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری…………………………….. 57

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE……………..

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد……………..59

3-15 دات بلات……………………………… 61

3-16 محلولها و بافرها…………………………… 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS…………………………….

3-16-2 محلول بلوکه کننده…………………………… 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T……………………………..

3-16-4 آنتیبادی اولیه……………………………. 62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه……………………………. 62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB…………………..

3-17 خالص سازی پروتئین…………………………….64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ………………….. 64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی……………… 65

3-19-1 تزریق اولیه…………………………… 65

3-19-2 تزریق‌های ثانویه  (Booster injection)……………………………. 66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ……………………………. 66

3-21 جداسازی IgY با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول 14700……………. 66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات……………… 67

4 نتایج و بحث……………………………… 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA……………………………..

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی…………………………….. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA……………………………..

4-4 بررسی محصولات PCR……………………………..

4-5 خالص سازی محصول PCR……………………………..

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA……………………………..

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α……………………………..

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+)………………………….

4-9 نتایج کلونی PCR…………………………….

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با استفاده از T7…………………………….

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی…………………………….. 75

4-12 توالی یابی…………………………….. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA……………………………..

4-14 بیان ژن……………………………. 78

4-15 SDS-PAGE…………………………….

4-16 دات بلات……………………………… 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ………… 81

5 نتیجه گیری و پیشنهادات……………………………… 85

چکیده:

هلیکوباکتر پیلوری شایع ترین پاتوژن گوارشی است که نیمی از مردم دنیا را آلوده ساخته و مهمترین علت بیماری‌های معده ای-روده ای از جمله گاستریک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است.  ژن CagA (سیتوتوکسین مرتبط با ژن A) یکی مهمترین شاخص‌های بیماری زای این باکتری است.  در این مطالعه به منظور همانه سازی بخش‌های آنتی ژنیک ژن CagA و بررسی تولید IgY در زرده تخم مرغ در ابتدا بر اساس برنامه‌های بیوانفورماتیکی قطعه حاوی اپی‌توپ‌های اصلی ژن CagA به طول 996 جفت باز شناسائی شد سپس این قطعه به کمک PCR از ژنوم هلیکوباکتر پیلوری موجود در بیوپسی معده 30 بیمار مبتلا به این باکتری جدا شده و با استفاده از هضم آنزیمی به ناقل  pET32a و سپس به داخل میزبان‌های کلون سازی و بیانی وارد شد.  نتایج توالی یابی کلونیگ موفق ژن CagA را نشان داد و در نهایت ترکیب پروتئینی بدست آمده توسط روش SDS-PAGE و دات بلات تائید شد. در مرحله بعد ترکیب پروتئینی بدست آمده به 3 مرغ از نژاد HY-LINE تزریق شد. تخم مرغ‌ها به مدت 10 هفته جمع آوری شدند و IgY تولید شده در زرده تخم مرغ آنها با استفاده از روش SDS-PAGE بررسی و تائید شد.

 

فصل اول

1- مقدمه

1-1- اهمیت موضوع

به آنچه که کامل کننده رژیم غذایی مورد نیاز افراد است، “مکمل” گفته می شود.  انرژی مکمل‌ها بر اساس نوع آن‌ها متفاوت است. به طور کلی مکمل‌های غذایی شامل مواد غذایی یعنی کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها، چربی‌ها، املاح، مواد معدنی و ویتامین‌ها هستند. از طرفی برخی مواد غذایی هستند که به طور طبیعی دارای اثراتی اثبات شده بر سلامتی می باشند اما مشاهده شده است که برخی مواد غذایی و یا نوشیدنی‌ها دارای اثراتی بر سلامتی هستند که این اثرات را نمی توان به محتوای مواد مغذی  (نظیر درشت مغذی‌ها، ویتامین‌ها و یا مواد معدنی) آن ماده ی غذایی نسبت داد این مواد غذائی غذاهای عمل گرا نامیده می شوند. امروزه مصرف کنندگان در بسیاری از موارد ترجیح می دهند اقلام مورد نیاز خود را از بین غذاهای عمل گرا انتخاب کنند. غذاهای عمل گرا محصولاتی مشتق از مواد غذایی می باشند که علاوه بر ارزش تغذیه ای آن‌ها، موجب ارتقای شرایط طبیعی فیزیولوژیک یا عملکرد ذهنی شده و یا در پیشگیری از اختلالاتی که می توانند به بیماری منجر شوند، موثر هستند (worldfood. ir).

هلیکو باکتر پیلوری شایع‌ترین موجود ذره‌بینی است که انسان‌ها را در بعد جهانی مبتلا به عفونت ساخته است و بیش از نیمی از مردم دنیا آلوده به این باکتری هستند (انجمن میکروب شناسی آمریکا، 2013). این باکتری نوعی باکتری گرم منفی مارپیچی شکل و یک پاتوژن گوارشی انسان است و مهمترین علت بیماری‌های معده ای-روده ای از جمله گاستریک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است  (کاور و بلاسر،1995).  بررسی‌های اپیدمیولوژی و آماری عفونت مزمن H. پیلوری را با سرطان بدخیم معده مرتبط دانسته اند و این امر موجب شده كه آژانس پژوهش سرطان سازمان بهداشت جهانی (World Health Organization: WHO)این باكتری را در زمره ی عوامل سرطان زای کلاس I قرار دهد (سوارز و همکاران،2006).  میزان عفونت H. پیلوری در جهان بطور میانگین 50% است اما بین شیوع این عفونت در كشورهای غربی و كشورهای آسیایی در حال توسعه تفاوت معنی داری وجود دارد (مالاتی و نیرن،2007).  به طوری كه این میزان در كشورهای غربی حدودا 30% جمعیت است که از این میان بین 1/0-1 درصد به سرطان معده مبتلا می شوند در حالی که میزان عفونت در کشور‌های آسیائی بالاتر و در حدود 80-60 درصد است (سوربن و میچتی،2002).  عفونت هلیکو باکتر پیلوری در ایران نیز شایع بوده و به خصوص سرطان معده از آمار بالائی بر خوردار است. این سرطان كه مسئول مرگ 650000 نفر در جهان در سال 2000 است، در مردها پس از سرطان ریه دومین عامل مرگ و میر ناشی از سرطان بوده و در مجموع حدود 10 درصد از كل مرگ و میر سالیانه سرطان را به خود اختصاص می دهد (پرینز و همکاران،2010).  میزان عفونت H. پیلوری در جمعیت اردبیل بالا و در حدود 89 درصد بوده است و یكی از بالاترین آمارهای جهان در رابطه با سرطان معده مربوط به استان اردبیل است كه به تنهایی حدود یك سوم تمام موارد سرطان در اردبیل بین سال‌های 1996 تا 1999 مربوط به این سرطان بوده است  (سجادی و همکاران،2003) (البرزی و همکاران،2006).  به علاوه بررسی‌ها در شهر شیراز نیز ابتلای 98-82 درصد كودكان بین 9 ماهه تا 10 ساله را به این باكتری نشان می دهد (البرزی و همکاران،2006) (ندیمی و همکاران،2000).  فاکتور بیماری زای cagA هلیکو باکتر پیلوری یک پروتئین با وزن مولکولی 120-145KD می باشد که در فاصله ی Kb 40 جزایر بیماری زائی[1] کد شده است. گونه‌های هلیکو باکتر پیلوری از نظر دارا بودن ژن CagA به گونه‌های مثبت[2] و منفی[3] تقسیم میشوند که تقریبا 60 درصد گونه‌های جدا شده از کشور‌های غربی و اکثریت گونه‌های جدا شده از شرق آسیا از نوع مثبت بودند (هاتاکیاما و هیگاشی،2005).  عفونت هلیکو باکتر پیلوری با لنفومای MALT و سرطان معده در ارتباط است و تصور می شود که CagA در گسترش سرطان نقش داشته باشد (لکس،2005).  ژن CagA فسفریله شده قادر به برقراری ارتباط با تیروزین فسفاتاز SHP-2 است که باعث عملکرد فعال و تغئیر ظاهری سلول میزبان به یک فنوتیپ متحرک تر می شود که به عنوان فنوتیپ مرغ مگس خوار شناخته شده است (هاتاکیاما و هیگاشی، 2005). این فنوتیپ شبیه به اثر تولید شده توسط فاکتور رشد کبدی بوده که ممکن است در جنبه‌های مختلف سرطان از جمله متاستاز دخالت داشته باشد (لکس،2005).  همچنین CagA یک پروتئین دارای خاصیت آنتی ژنیکی بسیار قوی است که با واکنش‌های برجسته ی التهابی تولید شده به وسیله ی استخراج اینترلوکین-8 در ارتباط است (یامائوکا،2010).  تشخیص سرطان معده در مراحل اولیه دشوار است و در اكثر موارد تشخیص پس از پیشرفت بیماری صورت گرفته و کار درمان سخت می شود در نتیجه مانند التهاب و زخم معده راه اصلی مبارزه با این سرطان نابود کردن عفونت H. پیلوری است از طرفی به دلیل اینکه سیستم ایمنی بدن در مقابل H. پیلوری دارای مکانیسم دفاعی است و حتی طی مكانیز م‌های ویژ ه ای در خدمت بیمار یزایی باكتری قرار می گیرد و سبب تسهیل اتصال باكتری وتخریب بافت پوششی می شود مبارزه با این عفونت همواره با مشکلاتی همراه است.  (سوارز و همکاران،2006). بعلاوه بررسی‌های اخیرنشان دهنده ی مقاومت نسبتا زیاد H. پیلوری به درمان‌های آنتی بیوتیکی است (موبلی و همکاران،1995). در نتیجه درمان‌های اخیر در جهت بکارگیری درمان‌های اختصاصی و نوین برای مقابله با این عفونت است که در این میان پروتئین CagA که یکی از پروتئین‌های H. پیلوری است هدف بالقوه مناسبی برای تولید آنتی بادی‌های اختصاصی به این منظور است. از سوی دیگر امروزه، در عرصة كاربرهای متنوع آنتی بادی‌ها، تكنولوژی جدید استخراج IgYاز زرده ی تخم مرغ در حال گسترش است. IgY که معادل IgG انسانی در پرندگان در نظر گرفته می شود در واقع از نظر تکاملی،نیای مادری IgG و IgE پستانداران است. این ایمنوگلوبین توسط مرغ تولید شده و برای ایجاد ایمنی غیر فعال برای جنین به درون زرده تخم مرغ انتقال می یابد. تکنولوژی IgY از این پدیده از طریق استخراج IgY از زرده ی تخم مرغ بهره می برد (بصیری و همکاران،2008). برای تولید یک واکسن موثر بر علیه هلیکو باکتر پیلوری، آنتی ژنی پایدار،حفاظت شده و قوی مورد نیاز است. امروزه تکنولوژی استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب پروتئینی برای ایمن سازی به سمت